3 курс / Фармакология / Синтез_и_изучение_свойств_новых_материалов_с_противоопухолевой
.pdf121
физиологического раствора использовали в качестве положительного и отрицательного контроля.
Агрегация тромбоцитов
После получения информированного согласия кровь для исследования брали у доноров (n=8), лиц обоего пола, не получавших в течение 7–10 дней препаратов,
влияющих на функцию тромбоцитов. Для предотвращения активации тромбоцитов кровь отбирали в вакутейнеры, содержащие 3,8 % цитрата натрия в качестве стабилизатора в соотношении цитрат натрия: кровь — 1:9.
Стабилизированную кровь центрифугировали 7 мин при комнатной температуре и 1000 об/мин. Часть богатой тромбоцитами плазмы (PRP) отбирали в пластиковую пробирку в количестве, необходимом для выполнения анализа. Из оставшейся крови получали бедную тромбоцитами плазму с помощью центрифугирования в течение 30 мин при 3600 об/мин. Бедная тромбоцитами плазма использовалась для калибровки шкалы оптической плотности агрегометра.
Количество тромбоцитов в исследуемой плазме влияет на результат измерения,
поэтому, проводилась стандартизация плазмы до получения концентрации тромбоцитов 200–250∙109 клеток/л с учётом добавления тестируемого вещества.
Концентрацию тромбоцитов определяли в режиме подсчёта тромбоцитов на агрегометре. Если концентрация тромбоцитов в плазме была выше стандартного уровня, то её разбавляли, добавляя бестромбоцитарную плазму.
Агрегацию тромбоцитов в PRP изучали с помощью анализатора агрегации тромбоцитов модели Solar AP 2110 при 37 и скорости вращения магнитной мешалки 1200 об / мин [109]. В тесте АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов использовался АДФ реактив для исследования функции тромбоцитов (НПО
«РЕНАМ»). Первичную (обратимую) агрегацию тромбоцитов оценивали по реакции на добавление к плазме пороговой дозы АДФ (C = 10 мкМ).
При оценке кривой агрегации наиболее информативным является максимальная амплитуда агрегации (MA) — максимальное увеличение коэффициента пропускания между моментом внесения агрегирующего агента и моментом прекращения изменения коэффициента пропускания — в % к
светопропусканию плазмы, бедной тромбоцитами.
122
Для изучения влияния соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 (с концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57) на индуцированную агрегацию тромбоцитов в кюветах смешивали 270 мкл PRP и 30 мкл раствора тестируемого вещества при конечных концентрациях 5, 10, 25, 50, 75, 100 и 200 мкМ, соответственно. Индуктор добавляли в кюветы через 5 мин после инкубации смеси при 37◦С. Агрегацию регистрировали до выхода кривой на плато.
Плазменно-коагуляционный гемостаз
К «клоттинговым» тестам относятся методы измерения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового времени
(ПВ) и тромбинового времени (TВ). Данные методы позволяют измерить промежуток времени с момента добавления реагента (активатора, запускающего процесс свёртывания) до формирования фибринового сгустка в исследуемой плазме.
Влияние на плазмо-коагуляционный гемостаз оценивали при добавлении его в плазму в тестах АПТВ, ПВ, ТВ.
Принцип метода АПТВ: исследование реакции рекальцификации плазмы в условиях стандартизации контактной и фосфолипидной активации свёртывания крови. С этой целью к плазме добавляют контактный активатор (каолин) и
парциальный тромбопластин, который в функциональном отношении подобен тромбоцитарным фосфолипидам. Чувствительность этого теста к дефициту плазменных факторов свёртывания (исключая факторы VII и XIII) выше, чем в тесте определения времени рекальцификации плазмы, но стандартная фосфолипидная активация делает невозможным выявление недостаточности коагуляционной активности тромбоцитов.
Принцип метода ПВ: определяют время свёртывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы в присутствии оптимального количества кальция и избытка тканевого тромбопластина. Это вариант определения времени рекальцификации плазмы с добавлением тканевого тромбопластина. В комплексе с фактором VII и
Са2+ он непосредственно активирует фактор Х, так что результаты теста зависят от активности фактора VII, фактора Х и факторов, включающихся в процесс свёртывания крови на этапах тромбино- и фибринообразования (факторов V, II и I).
Принцип метода ТВ: метод основан на способности тромбина индуцировать превращение фибриногена в фибрин без участия других факторов свёртывания
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
123
крови, т. е. позволяет оценить конечный этап свёртывания крови (фибриноген и его производные, активность фактора ХIII).
Для исследования использовали коммерческую нормальную плазму
(«Технология-Стандарт», Россия). Для определения AПТВ, ПВ и TВ использовали наборы реагентов «АПТВ-ТЕСТ», «ТЕХПЛАСТИН-ТЕСТ» и ТРОМБО-ТЕСТ» фирмы «Технология-Стандарт», Россия. Исследования проводили на коагулометре АПГ2-02-П («ЭКМО»). Для исследования смешивали 50 мкл плазмы и 50 мкл раствора (дисперсии) изучаемого вещества при конечных концентрациях 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200 мкМ (соединений 1.57, 3.6 GO-1.57 (с концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57)). Далее растворы (дисперсии) инкубировали при 37 °C в течение 60
сек и в соответствии с протоколом исследования определяли время свёртывания на коагулометре в тестах AПТВ, ПВ и TВ.
Изучение термодинамических параметров связывания с ДНК и ЧСА
калориметрическим методом
Эксперименты проводились с использованием микрокалориметра титрования
TA Instruments Nano ITC 2G (TA Instruments, США), оснащённого золотой измерительной ячейкой объёмом 1 мл по методике, описанной в работе [110]. Для проведения измерений в ячейку помещали раствор ЧСА (C = 1∙10−4 М) или раствор ДНК (C = 5∙10−3 M). После установления равновесия к содержимому ячейки при непрерывном перемешивании добавляли растворы соединений 1.57, 3.6 и дисперсии
GO-1.57 (с концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57) (C = 1∙10−3 М) путём последовательных инъекций по 10 мкл. В качестве среды для протекания изучаемой реакции использовался фосфатно-солевой буфер (PBS). Интервал между инъекциями составлял 40 мин, скорость вращения мешалки — 250 об/мин. Точность поддержания температуры в ходе эксперимента составляла ±0,0003 К.
Изучение связывания с ДНК спектральными методами
УФ-спектры были зарегистрированы в диапазоне 200–400 нм на спектрометре
Beckman Coulter DU 800 с использованием кварцевых кювет (l = 1 см). Спектры кругового дихроизма (КД) записывали на спектрополяриметре Jasco J-810 (l = 0,2
см). Для соединений 1.57, 3.6, GO-1.57 и рабочих растворов ДНК проверялось соблюдение закона поглощения в диапазоне концентраций (C = 3,6–24,7 мкМ (для растворов ДНК), C = 1–100 мкМ (для растворов соединений 1.57, 3.6 и дисперсии
124
GO-1.57 (с концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57)). Спектральные эксперименты проводили в физиологическом растворе при pH 7,4. Рабочие растворы получали смешением растворов ДНК и растворов соединений 1.57, 3.6 и дисперсии
GO-1.57 (с концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57) при комнатной температуре.
Антиоксидантная активность
Изучение антирадикальной активности
Исследование антирадикальной активности со стабильным радикалом 2,2-
дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПГ) проводили на спектрофотометре Thеrmо Sсiеntifiс Еvоlutiоn 300. Для этого был приготовлен раствор ДФПГ в этаноле с концентрацией (130 мкМ), раствор соединений 1.57, 3.6 и дисперсии GO-1.57 (с
концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57) в буфере PBS с концентрацией 200
мкМ. В кварцевую кювету после термостатирования помещали 1 мл раствора ДФПГ и 1 мл раствора соединений 1.57, 3.6 и дисперсии GO-1.57. В кювету сравнения вносили смесь этанола с водой (1:1). Для получения кинетической кривой восстановления ДФПГ регистрировали оптическую плотность на спектрофотометре при 515 нм, при температурах 303,15 К, 308,00 К, 313,00 К, 318,00 К в темноте через каждую минуту в течение 30 мин, а также через 6 дней после начала реакции.
Точность термостатирования составляла T = 0,1 К.
Фотодинамические свойства
Для исследования фотодинамических свойств были записаны спектры поглощения следующих образцов:
1.Радахлорин.
2.Раствор, содержащий Радахлорин и соединения 1.57, 3.6, а также GO-1.57
вразличных концентрациях (C = 5–200 мкМ).
3.Раствор Радахлорина, содержащий 500 мкМ азида натрия до и после облучения красным лазером Laserland LED-2000 (Besram Technology Inc., мощность лазера 55 мВт, 659 нм). Влияние соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 на фотообесцвечивание Радахлорина оценивали путём расчёта константы скорости фотодеградации kdeg.
Фотоиндуцированный гемолиз
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
125
Эритроциты получали из цитратной крови путём центрифугирования при
1500 об/мин в течение 10 мин с последующей трёхкратной промывкой физиологическим раствором. Далее клетки стабилизировали не менее суток при 4 °C
в реактиве Олсвера, который применяется как антикоагулянт и состоит из хлорида натрия (0,42 %), лимонной кислоты (0,055 %), цитрата натрия (0,8 %) и D-глюкозы
(2,05 %).
Перед использованием эритроциты трижды отмывали от реактива Олсвера физиологическим раствором, и готовили стандартную суспензию клеток в PBS (pH 7,4). Оптическая плотность стандартной суспензии после разведения её в 8 раз буферным раствором составляла 0,560 ± 0,020 при 800 нм. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 в кювете с длиной оптического пути 5 мм. Регистрацию цитолитической активности соединений 1.57, 3.6 и дисперсии GO-1.57 (с
концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57) осуществляли путём регистрации снижения оптической плотности суспензии клеток при 800 нм через пятисекундные интервалы до полного гемолиза [111]. Измерения проводили в термостатируемой кювете спектрофотометра при 37 °C; концентрация исследуемого образца варьировалась в диапазоне от 5–200 мкМ.
Антиоксидантные свойства оценивали с использованием устройства для исследования фотоиндуцированного цитолиза по методике, опубликованной ранее
[111]. Согласно этой методике в экранированной кювете с длиной оптического пути
5 мм готовили инкубационную смесь, содержащую 0,1 мл стандартной суспензии эритроцитов, 0,6 мл PBS (pH 7,4), 0,08 мл раствора с различным содержанием соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 и 0,02 мл фотосенсибилизатора Радахлорин (0,35 %
раствор для внутривенного введения, основная субстанция — (7S,8S)-13-винил-5-
(карбоксиметил)-7-(2-карбоксиэтил)-2,8,12,17-тетраметил-18-этил-7H,8H-
порфирин-3-карбоновая кислота). В качестве контроля использовали инкубационную смесь, содержащую физиологический раствор. Полученную инкубационную смесь, общим объёмом 0,8 мл, термостатировали в кюветном отсеке спектрофотометра в течение трёх минут при 37 °C и постоянном перемешивании,
затем облучали красным лазером Laserland LED-2000 (доза облучения — 3,5
Дж/см2). После завершения облучения регистрировали снижение оптической плотности раствора при 800 нм.
126
Изучение связывания NO-радикалов
Для определения степени связывания NO-радикалов использовали модельную реакцию Грисса — Илосвая [111, 116]. Нитропруссид натрия при физиологическом значении pH является донором NO-радикалов, взаимодействие которых с кислородом приводит в результате ряда превращений к образованию нитрит анионов (NO2−). Образовавшиеся в результате реакции нитрит-анионы определяются с помощью реактива Грисса (наблюдается розово-фиолетовое окрашивание раствора). Для проведения эксперимента реакционную смесь,
содержащую 1 мл нитропруссида натрия (C = 15 мкM) и 0,5 мл водного раствора соединений 1.57, 3.6 и дисперсии GO-1.57 (с концентрациями в пересчёте на загрузку 1.57) (C = 10–200 мкM) инкубировали 150 мин в шейкере-термостате при
60 °C. Затем к 0,25 мл полученного раствора добавляли 0,5 мл PBS (pH 7,4) и 0,5 мл
1 % раствора реактива Грисса. Полученную смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Образовавшееся диазосоединение определяли спектрофотометрическим методом при λ = 540 нм. В качестве контроля использовались аналогичные концентрации азида натрия.
Генотоксичность
Генотоксичность соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 оценивали с использованием метода ДНК-комет, основанного на измерении влияния тестируемых образцов на целостность ДНК мононуклеарных клеток периферической крови человека с использованием щелочного гель-электрофореза [111, 116]. ДНК-кометы визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Micromed 3 LUM.
Измерения длин хвостов проводились с использованием программного обеспечения
CASP (версия 1.2.2). Содержание ДНК в хвосте и длина хвоста были определены экспериментально; момент хвоста был рассчитан как процентное содержание ДНК в хвосте, умноженное на расстояние между центром головы и хвоста [132].
Цитотоксичность
МТТ-тест (колориметрический тест с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-
дифенилтетразолий бромидом) для соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 проводили на клеточных линиях аденокарциномы печени человека (SK-HEP-1), глиобластомы человека (T98G), аденокарциномы альвеолярного базального эпителия человека
(A549), тератокарциномы яичника человека (PA-1), в качестве контрольной линии
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
127
использовалась клеточная линия почки эмбриона человека (HEK293), в качестве контрольного вещества — доксорубицин (2, 10, 20, 50, 100, 150 и 200 мкМ). Клетки в концентрации 5∙103 на лунку помещали в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 12 ч в среде DMEM-F12 с добавлением 10 % термически инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 % L-глутамина, 50 Ед∙мл−1 пенициллина и 50
мкг∙мл−1 стрептомицина. После культивирования в лунки добавляли свежую среду
DMEM-F12, содержащую различные концентрации тестируемых веществ, и
планшет затем инкубировали при 37 °C в увлажнённой атмосфере CO2-инкубатора в присутствии 20 % O2, 5 % CO2. Через 48 ч в лунки добавляли 0,1 мл DMEM-F12 и 0,02 мл МТТ-реагента (5 мг·мл−1) и продолжали инкубировать в течение 1 ч, после чего удаляли супернатант. Образовавшиеся при восстановлении МТТ жизнеспособными клетками кристаллы формазана растворяли в 0,1 мл ДМСО и измеряли оптическую плотность на планшетном спектрофотометре BioRad x Marx
при λ = 540 нм, вычитая фоновую оптическую плотность при λ = 690 нм. Для каждой клеточной линии была определена концентрация полумаксимального ингибирования (IC50). Полученные значения сравнивались с IC50 доксорубицина и цисплатина.
Мембранный митохондриальный потенциал
Клетки PANC-1 обрабатывали трипсином и промывали PBS, содержащим 10 %
FBS. После этого клетки ресуспендировали в смеси PBS, 5 % FBS и 50 мМ KCl. После инкубации клеток с флуоресцентным красителем MitoTracker® Orange CMTMRos (500
нМ) при 37 °C в течение 30 мин их промывали PBS и высевали в чёрный 96-луночный планшет (80 000 клеток на лунку). Концентрация тестируемых веществ (соединений
1.57, 3.6 и GO-1.57) и доксорубицина в конечных суспензиях составляла 100 мкМ. Для рассеивания протонного градиента добавляли 10 мкМ FCCP (карбонилцианид-п-
трифторметоксифенилгидразон). Измерения флуоресценции проводили с помощью планшетного-ридера Varioscan Lux при длинах волн возбуждения/испускания 554/576
нм.
Взаимодействие с ЧСА
Связывание соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 с ЧСА проводили на спектрофлуориметре СМ 2203. Спектры эмиссии регистрировали в диапазоне длин волн 310–450 нм и диапазоне температур 298,15–31,15 К; длина волны возбуждения
128
— 290 нм. Концентрация ЧСА составляла 3 мкМ, концентрации соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 варьировалась в диапазоне C = 0,3–1,5 мкМ с шагом 0,3 мкМ и в диапазоне C = 6,0–24,0 мкМ с шагом 3,0 мкМ. Измерения проводились в отсутствие и в присутствии маркеров сайтов связывания (варфарин, ибупрофен, дигитонин с конечной концентрацией C = 3 мкМ).
Эстеразная активность ЧСА
Для оценки влияния соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 на эстеразную активность ЧСА были приготовлены следующие растворы: п-нитрофенилацетат в этаноле, ЧСА,
соединений 1.57, 3.6 и GO-1.57 в PBS с pH 7,02 [133]. После смешения растворов итоговая концентрация п-нитрофенилацетата составила 100 мкМ, ЧСА 3 мкМ,
концентрация 1.57, 3.6 и GO-1.57 варьировалась от 0 до 24 мкМ. Скорость гидролиза
п-нитрофенилацетата оценивали по образованию продукта реакции — п-
нитрофенола. Изменение оптической плотности регистрировалось спектрофотометрическим методом при длине волны 405 нм в течение первых 10 мин от начала реакции. В результате были получены кинетические зависимости реакции гидролиза п-нитрофенилацетата ЧСА в отсутствие и в присутствии 1.57, 3.6 и GO-
1.57.
Эндоцитоз
Механизмы эндоцитоза изучались с помощью МТТ-теста, по уменьшению токсического воздействия 1.57, 3.6 и GO-1.57 на клетки HeLa в присутствии следующих ингибиторов эндоцитоза: CK-636 (ингибитор актин-зависимого эндоцитоза); нистатин (ингибитор кавеолин-зависимого эндоцитоза); динасор
(ингибитор динамин-зависимого эндоцитоза); хлорпромазин (ингибитор клатрин-
зависимого эндоцитоза); амилорид (ингибитор пиноцитоза). Ингибиторы эндоцитоза использовались в концентрации C = 10 мкM. Данные по цитотоксичности в присутствие ингибиторов сравнивались с контролем в отсутствии ингибиторов.
Иммуноблоттинг
Клетки линий A549 и HeLa высевали в культуральную среду DMEM-F12 на чашки Петри (d=10 см) с плотностью 4·106 клеток. Через 24 ч культуральную среду удаляли и добавляли DMEM-F12, содержащую 50 мкМ CoCl2, тестируемые образцы и селективный ингибитор трансляции HIF-1α KC7F2 (прединкубация проводилась в
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
129
течение 8 ч). Затем клетки гомогенизировали в буфере для радиоиммунопреципитации (150 мМ NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,5 % дезоксихолата натрия, 0,1 % додецилсульфата натрия, 50 мМ раствора трис-HCl (pH 8,0) и
протеазного ингибиторного коктейля (1:100, Sigma) при +4 °C в течение 30 мин и центрифугировали при 12 000 g (+4 °C, 20 мин). Содержание общего белка в клеточных лизатах определяли с помощью реактива Бредфорда. В качестве стандарта использовался ЧСА. Исследуемые образцы разбавляли буфером Лэммли и проводили электрофорез в 12 % полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Для переноса белков с полиакриламидного геля использовалась нитроцеллюлозная мембрана с диаметром пор 0,2 мкм (Bio-Rad).
Перенос белков осуществлялся в камере для электроблоттинга (Bio-Rad) при силе тока 0,3 А в течение 2 ч. После блокирования неспецифических сайтов связывания на мембране с использованием 5 % обезжиренного молока в буферном растворе
PBS-T (PBS + 0,1 % Твин-20), мембраны инкубировали со специфическими антителами к HIF-1 (Abonova; разведение 1:1000), в течение 2 ч. После трёх отмывок с использованием PBS-T мембраны инкубировали со вторичными антителами,
конъюгированными с пероксидазой хрена. Хемилюминесцентный субстрат для детектирования активности пероксидазы хрена использовался в соответствии с инструкцией производителя (Bio-Rad). Интенсивность сигнала хемилюминесценции регистрировалась на приборе Chemidoc (Bio-Rad). Для проверки эквивалентности содержания общего белка проводился иммуноблоттинг к β-актину с использованием моноклональных мышиных антител против человеческого β-актина (Santa Cruz
Biotechnology; разведение 1:6000).
Статистический анализ
Статистический анализ проводился с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft). Нормальность распределения проверялась тестом Шапиро — Уилка.
Данные выражены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего.
Статистические различия были проверены с использованием критерия Стьюдента для независимых выборок или с использованием дисперсионного анализа с последующим применением post-hoc критерия Тьюки. Статистически значимыми считались различия при р < 0,05.
130
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. Разработаны синтетические подходы к получению полиазотистых гетероциклов на основе 1,3,5-триазинов, являющихся потенциальными цитостатическими препаратами. Полученные соединения охарактеризованы с использованием комплекса физико-химических методов ЯМР-, ИК-спектроскопии, масс-
спектрометрии, рентгеноструктурного анализа, термогравиметрического анализа,
рентгенофазового анализа и элементного анализа.
2. Показано, что соединения 1.57, 3.6 и GO-1.57 являются гемосовместимыми,
проявляют цитотоксическое действие на клеточных линиях A549, HeLa, PANC-1, SK-HEP-1 и T98G, сопоставимое или по своему эффекту превышающее действие таких цитостатических препаратов как цисплатин и доксорубицин. Комплекс исследований по изучению взаимодействия соединений 1.57 и 3.6 с ДНК позволяет заключить, что они обладают смешанным механизмом действия. Соединения-
лидеры обладают высокой антиоксидантной активностью и, как следствие, могут оказывать влияние на антиксидантно-прооксидантное равновесие в опухолевых клетках.
3. Проведено комплексное изучение физико-химических свойств соединения 1.57, а
именно температурных и концентрационных зависимостей плотности, вязкости,
скорости звука и показателя преломления. Показана амфифильность и высокая растворимость соединения 1.57 в воде (до 43 г/л). Установлено, что синтезированные соединения 1.57 и 3.6 является неустойчивыми в слабокислой среде и гидролизуется с раскрытием диоксанового цикла. Совокупность полученных данных подтверждает гемосовместимость и свидетельствует о мембранотропности соединения-лидера.
4. Разработан метод синтеза нековалентного конъюгата на основе оксида графена с повышенном содержанием кислородсодержащих функциональных групп (до 85 %)
и соединения 1.57 (загрузка препарата составляет 61 %). Полученный конъюгат охарактеризован с использованием комплекса физико-химических методов.
5. Установлено, что конъюгат GO-1.57 проявляет антиоксидантную активность,
является гемосовместимым, а также обладает клеточно-специфической
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/