3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

ГЛАВА 1

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф. Е.В. Арзамасцев; д. м. н., проф. И.В. Березовская; д. м. н. О.Л. Верстакова; член-корр. РАМН, проф. Т.А. Гуськова; член-корр. РАМН, проф. А.Д. Дурнев; к. б. н. А.С. Иванова; к. б. н. Л.В. Крепкова; к. б. н. А.В. Сорокина

Введение

Доклинические токсикологические исследования направлены на выявление и оценку выраженности токсических эффектов, возникающих при взаимодействии фармакологического вещества с организмом лабораторных животных. Согласно Федеральному закону от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» они являются неотъемлемой частью доклинических исследований, направленных на получение доказательств безопасности лекарственных средств (ЛС). Конечной целью доклинических токсикологических исследований является получение данных, достаточных для определения возможности и риска проведения клинических исследований (КИ) ЛС.

Доклинические исследования проводятся в соответствии с существующими правилами лабораторной практики, утвержденными уполномоченным федеральным органом исполнительной власти РФ (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики»).

При исследовании общетоксического действия решаются следующие задачи:

1.Выявляются переносимые и токсические дозы фармакологического вещества.

2.Устанавливаются органы и системы организма, наиболее чувствительные к изучаемому фармакологическому веществу, определяется характер и степень патологических изменений.

3.Определяется зависимость токсических эффектов от дозы и длительности применения фармакологического вещества и обратимость патологических изменений.

1.Общие положения. Условия проведения эксперимента

Токсикологические исследования обязательны для субстанции оригинального

фармакологического вещества и всех лекарственных форм на ее основе. Если лекарственная форма содержит вспомогательные вещества (стабилизаторы, растворители и т.п.), не разрешенные для применения в медицинской практике, то каждое из этих веществ подвергают отдельному токсикологическому исследованию. При комбинации нескольких фармакологических веществ в одной лекарственной форме (фиксированная комбинация) изучают токсичность комбинации в целом и каждого ингредиента в отдельности, если он не был ранее разрешен для применения в медицинской практике. При изменении способа получения фармакологического вещества или лекарственной формы проводится повторная токсикологическая оценка на одном наиболее чувствительном виде животных, который определяется исходя из данных первоначальных исследований.

При изменении количественного соотношения ингредиентов в лекарственной форме или увеличении дозировки следует провести ревизию уже имеющихся данных для обо-

13

снованного решения вопроса о необходимости проведения дополнительных токсикологических исследований и их объеме.

2. Фармакологическое вещество

Сведения о структуре, физико-химических свойствах, растворимости, условиях хранения, фармакологической активности с представлением данных экспериментальных исследований, предполагаемых дозах и путях введения в клинике, а также другие значимые для проведения эксперимента сведения о свойствах субстанции фармакологического вещества или его лекарственной формы, предоставляются разработчиком. В том числе в виде предварительной нормативной документации (проект ФС, аналитический паспорт вещества и пр.) на фармакологическое вещество.

Для лекарственных форм предоставляются проект ФСП, сертификат соответствия и характеристика вспомогательных веществ, использованных при ее получении (растворители, наполнители, стабилизаторы и др.).

3. Общие принципы выполнения исследований

Токсикологические исследования проводят на здоровых половозрелых животных и, при необходимости, на животных моделях патологических состояний. Это правило имеет ряд исключений.

1. Фармакологические вещества, предполагаемые для применения у детей, следует тестировать на новорожденных и неполовозрелых животных.

2 Фармакологические вещества, предназначенные для разработки гериатрических лекарств, следует тестировать на старых животных.

3.Фармакологические вещества, предназначенные для разработки лекарств для беременных, исследуют на беременных животных.

4.Лабораторные животные

Для токсикологических исследований применяют здоровых половозрелых животных, полученных из сертифицированных питомников и прошедших карантин в течение 10—14 дней. Получение животных от не сертифицированных производителей не допускается.

Исследования проводят на нескольких видах животных, причем наряду с грызунами обязательно использовать не грызунов. Для токсикологических исследований рекомендуются мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки, мини-свиньи и обезьяны.

Токсикологические исследования можно проводить как на нелинейных, так и на линейных животных. В последнем случае следует указать линию животных, поскольку чувствительность к токсическому действию может быть генотипически зависима. При прочих равных условиях в исследованиях по определению острой и хронической токсичности предпочтительнее использование аутбредных животных.

Исследования проводят на животных обоего пола одного возраста, разброс по исходной массе не должен превышать ± 10%.

Содержание животных определяется Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики».

Рекомендуется содержание грызунов в индивидуальных клетках, также неприемлема излишняя скученность животных.

Следует учитывать, что чувствительность животных к фармакологическому веществу может изменяться под влиянием ряда внешних факторов (температура, влажность, освещенность и кратность воздухообмена помещения, состав подстилок, загрязненность помещения ксенобиотиками, состава корма, времени кормления и др.). В этой связи условия содержания животных, получающих фармакологическое вещество, и контрольных животных должны быть идентичными.

Животные содержатся на стандартных, сертифицированных комбикормах в соответствии с действующими нормами при свободном доступе к воде и пище.

14

4.Стандартные процедуры при работе

слабораторными животными

Все исследовательские работы с лабораторными животными выполняются в соответствии с общепринятыми этическими нормами обращения с животными, на основе стандартных операционных процедур, принятых в организации — производителе исследований, которые соответствуют правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986).

5. Планирование эксперимента

При планировании хронического токсикологического исследования следует учитывать возможную необходимость оценки динамики возможного токсического эффекта, что особенно важно при длительности введения свыше 3-х месяцев. С этой целью в исследование вводят группы животных, предназначенных для исследований в промежуточные сроки. Кроме того, необходимо предусматривать изучаемые группы для оценки обратимости наблюдаемых эффектов («отставленные группы»).

Число животных в каждой группе должно быть достаточным для того, чтобы оценить характер и частоту проявления токсических эффектов и подвергнуть результаты исследований адекватной статистической обработке. Группа должна содержать не менее 10 особей каждого пола. Данные, полученные на самках и самцах, учитываются и анализируются раздельно.

Фармакологические вещества вводят в фиксированное время суток с целью предупреждения ошибок, связанных с суточными ритмами. Для исключения ошибок, связанных с сезонными ритмами, обязательно параллельное ведение групп животных, получающих фармакологическое вещество, и контрольных.

При исследовании хронической токсичности фармакологических веществ не рекомендуется применение дополнительных растворителей. При необходимости их использования исследование должно быть дополнено еще одной изучаемой группой — «контроль на растворитель».

6. Изучение острой токсичности

6.1. Общие положения

Острая токсичность — токсикометрическая характеристика фармакологического вещества или лекарственного препарата (ЛП), выражающая его способность вызывать гибель животных при однократном введении или при введении через короткие (не более 6 ч) интервалы времени в течение суток.

Целью изучения острой токсичности является определение переносимых, токсических и летальных доз фармакологического вещества и причин наступления гибели животных с анализом клинической картины интоксикации.

Параметры острой токсичности ЛС могут быть вычислены с помощью любых статистических методов, однако предпочтительнее пользоваться методами, позволяющими провести сравнительную оценку исследованных параметров для двух или более фармакологических веществ. Использованный метод расчета среднелетальных доз должен быть обязательно указан в отчете, например, «метод Литчфилда и Уилкоксона».

В исследованиях с использованием крупных животных достаточно описания токсических эффектов без достижения летальности.

6.2. Вид и количество лабораторных животных

Острая токсичность изучается на нескольких видах животных. Причем обязательно используют тот вид животных, на которых была показана специфическая фармаколо-

15

гическая активность вещества и которые будут использоваться при исследовании хронической токсичности. Обычно используют 2 вида животных. Исследования на самцах и самках проводят раздельно, минимальный размер группы 5–6 особей грызунов, при использовании собак или кроликов 3–5 особей.

Полученные результаты должны адекватно обеспечить возможность вычисления ЛД50, что предполагает наличие среди изучаемых групп одной группы со 100% летальностью и одной, в которой гибель животных отсутствует. Если из-за низкой токсичности фармакологического вещества нельзя определить ЛД50, следует указать максимальную дозу, которая была введена животным, но не менее 2 г/кг.

6.3.Пути введения

Умелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества исследуют при нескольких путях введения, причем обязательно используется тот путь, при котором была показана специфическая фармакологическая активность вещества, и путь, который предполагается для клинического применения. Фармакологические вещества, предназначенные для системного введения, вводят перорально и парентерально (внутрибрюшинно, если они не растворимы в воде, внутривенно и подкожно, если они растворимы). Следует учитывать, что при определении токсичности имеют значение концентрация и объем вводимого фармакологического вещества, а при внутривенных инъекциях также скорость введения. Фармакологические вещества, предлагаемые для местного применения, наносят или вводят в соответствующую область согласно способу, предлагаемому для клиники.

Фармакологические вещества, предлагаемые для приема внутрь, следует вводить через зонд, закладывать на корень языка.

Фармакологические вещества, рекомендованные для ингаляции, изучают, помещая мелких лабораторных животных в затравочные камеры, снабженные специальными затравочными устройствами.

Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания фармакологического вещества, а сопоставление прямых, отражающих зависимость величины токсического эффекта от дозы, позволяет судить о сходстве или различии в механизмах, вызывающих летальный исход при разных путях введения.

6.4.Продолжительность наблюдения

ирегистрация картины интоксикации

Общая продолжительность наблюдения за животными при исследовании острой токсичности должна составлять не менее 14 дней, причем в первый день после введения животные должны находиться под непрерывным наблюдением.

Регулярно фиксируют общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координации движений, тонус скелетных мышц, реакцию на тактильные, болевые, звуковые

исветовые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние шерстного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, размер зрачка, положение хвоста, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания и окраску мочи, потребление корма и воды, изменение массы тела

идругие показатели, характеризующие токсическое действие. Для соответствующих групп фармакологических веществ целесообразно исследовать некоторые гематологические показатели (морфологические, биохимические, свертываемость крови).

Обязательна регистрация сроков развития интоксикации и гибели животных. Целесообразно проведение макроскопического исследования внутренних органов погибших животных, а в случае отсроченной гибели животных — и микроскопическое исследование (степень кровенаполнения органов, наличие кровоизлияний, изъязвлений слизистых оболочек и др.).

16

Рекомендуемая форма представления результатов приведена в таблице (табл. 1).

Таблица 1

Форма представления результатов

6.5. Исследование кумуляции

При выборе доз для исследования хронической токсичности фармакологического вещества следует учитывать его кумулятивное действие. Поэтому до проведения хронических токсикологических исследований часто возникает потребность в определении индекса кумуляции фармакологического вещества, т. е. отношение ЛД50 при однократном введении к ЛД50 при кратном введении. Для этой цели можно использовать различные методы, основанные на учете гибели животных при повторном введении фармакологического вещества.

Предпочтение следует отдать оценке кумуляции методом Lim R.K. (1961), позволяющим оценить не только кумулятивные свойства, но и привыкание.

В таблице 2 приведен алгоритм изучения кумуляции методом субхронической токсичности по Lim R.K. и соавторам (минимальное число животных в группе 10 особей).

Таблица 2

Изучение кумуляции методом субхронической токсичности

Суммарная доза за 24 дня — 12,8 ЛД50, максимальная продолжительность эксперимента 24±4 дня. Вывод об эффекте вещества делается на основании величины коэффициента К, при К < 1 — кумуляция, или К > 1 — привыкание. Коэффициент определяется как частное из отношения ЛД50 при однократном введении к ЛД50 при повторных введениях.

7. Изучение хронической токсичности

7.1. Общие положения

Целью хронических токсикологических исследований является характеристика повреждающего действия фармакологического вещества при его длительном введении, выявление наиболее чувствительных органов и систем организма, а также исследование возможности обратимости вызываемых повреждений.

17

Продолжительность введения фармакологического вещества при изучении хронической токсичности зависит от предполагаемой длительности его применения в клинике, планируемой фазы КИ и видовой принадлежности лабораторных животных (см. табл. 3).

*) Допускается более длительное введение препаратов.

7.2. Вид и количество лабораторных животных

Хроническую токсичность изучают не менее чем на двух видах животных. Желательно использовать животных, на которых были получены сведения о специфической фармакологической активности вещества.

Изучение хронической токсичности проводится на крысах, кроликах и/или собаках. Группы животных формируют из самок и самцов.

7.3. Пути введения фармакологического вещества

Путь введения фармакологического вещества в эксперименте должен соответствовать рекомендованному для КИ. Фармакологическое вещество, предназначенное для применения внутрь, вводят лабораторным животным через зонд в желудок или закладывают на корень языка, так как это обеспечивает более точное дозирование, чем добавление фармакологического вещества в корм. Количество фармакологического вещества, получаемого животным за один прием, выражают на единицу массы тела или единицу поверхности тела животного в пересчете на действующее вещество. Фармакологическое вещество вводят в виде субстанции и/или лекарственной формы. Лекарственные формы, предназначенные для регулируемого высвобождения вещества, не подлежат измельчению.

7.4. Исследуемые дозы

Хроническую токсичность фармакологического вещества при его системном применении исследуют в двух–трех дозах. При выборе доз руководствуются результатами, полученными при исследовании специфической фармакологической активности и острой токсичности фармакологического вещества, его способностью вызывать кумулятивный эффект, а также предполагаемыми максимальными суточными дозами, в которых фармакологическое вещество рекомендовано для клинического изучения.

Введение максимальной дозы предполагает выявление возможных токсических эффектов или гибель части животных. Эта доза может быть определена из данных по острой токсичности. Минимальная доза должна быть близка к терапевтической дозе, рекомендуемой для клинического изучения, с учетом соответствующих коэффициентов. Третья доза является промежуточной.

18

Фармакологические вещества, предназначенные для ежедневного применения у человека, вводят животным 7 дней в неделю.

7.4.1. Межвидовой перенос доз

При планировании и проведении токсического исследования часто возникает потребность в межвидовых пересчетах доз. Это существенная проблема, поскольку сегодня не существует универсального алгоритма пересчета доз для всех классов фармакологических соединений. Принципиально, что выбор способа перерасчета дозы всегда должен быть научно обоснован. Для одних веществ (психотропные, адаптогенные, нейропротекторные и ряд других) приемлем прямой перенос дозы с единицы массы животных одного вида на единицу массы животных другого вида. Для других соединений, относящихся к цитотоксическим ядам (цитостатики, антиаритмики, антипаразитарные и ряд других), адекватен перерасчет исходя из поверхности тела.

7.5.Наблюдение за животным

ирегистрация картины интоксикации

На протяжении всего исследования животные должны находиться под ежедневным наблюдением; отмечают потребление корма и воды, состояние шерстного покрова и слизистых оболочек, поведение. Один раз в неделю животных взвешивают, регулярно (в исследовании продолжительностью свыше 1 месяца — не менее 2 раз) исследуют функциональное состояние сердечно-сосудистой, нервной, выделительной и пищеварительной систем, изучают морфологические и биохимические показатели крови. Методы исследования для оценки функционального состояния органов и систем организма выбирает исследователь: они должны быть современными и достаточно чувствительными, чтобы обеспечить регистрацию признаков возможного повреждающего действия изучаемого фармакологического вещества.

Примерная программа оценки токсичности фармакологического вещества представлена в приложении 1.

Все животные, погибшие в течение исследования, подвергаются вскрытию для установления характера повреждающего действия фармакологического вещества. До и после окончания введения фармакологического вещества проводят максимально полное обследование животных с помощью гематологических, биохимических и физиологических тестов. Животных каждой группы подвергают эвтаназии для патоморфологических исследований. Проводят патологоанатомическое вскрытие с оценкой макроскопической картины места введения препарата и внутренних органов, определяют их абсолютную и относительную массу, проводят гистологическое исследование. За животными «отставленной» группы проводят наблюдение в течение 1 месяца, после чего их обследуют в том же объеме, что и животных, подвергшихся эвтаназии сразу после окончания введения фармакологического вещества. Исследования на мелких лабораторных животных проводят с таким расчетом, чтобы полученные результаты можно было подвергнуть статистической обработке.

При оценке изменений, наблюдаемых у животных в хроническом токсикологическом исследовании, необходимо исключить возможность влияния всех побочных факторов, не связанных с приемом препарата (содержание, кормление, заболевание животных и т. п.).

Могут возникнуть флуктационные изменения гемограмм, биохимических показателей и анатомических характеристик, которые следует учитывать при объяснении результатов. В ряде случаев в дополнение к указанным выше методам может потребоваться применение дополнительных биохимических исследований, электронной микроскопии, гистохимических, авторадиографических и других методов исследования.

Патологические изменения, возникающие у животных после введения высоких доз фармакологического вещества, дают ценную информацию для характеристики его токсических свойств, однако эта информация должна быть подвергнута тщательному анализу и полученные результаты следует рассматривать в качестве предупреждения, а не противопоказания для КИ.

19

8.Обработка и хранение данных, подготовка отчета

изаключения по результатам исследований

Первичные данные доклинического токсикологического исследования должны документироваться и храниться в соответствии с требованиями, определяемыми Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики».

В отчете представляются все первичные данные в виде таблиц и/или графиков, они должны быть обработаны статистически, заключения и выводы должны базироваться на статистических заключениях. Общие принципы статистической обработки данных биологических исследований представлены в специальном разделе настоящего руководства.

Оформление отчета осуществляется в соответствии с ГОСТом 7.32-2001 «Отчет о научно-исследовательской работе» и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики».

Заключение должно содержать обоснованное мнение авторов о возможности КИ изученного ЛС. При решении и обосновании этого вопроса следует учитывать следующие факторы:

1.Терапевтическую широту фармакологического вещества, т.е. соотношение минимальной токсической и терапевтической доз.

2.Характер и обратимость выявленной патологии.

Заключение должно содержать суждения исследователей о степени опасности острого и хронического отравления, прогноз возможных побочных реакций и рекомендации по необходимым ограничениям применения ЛС при КИ.

Схема отчета об исследовании общетоксического действия фармакологического вещества

Отчет должен содержать следующие разделы: титульный лист, список исполнителей, оглавление, реферат, введение и общие положения, материалы и методы, результаты проведенных исследований, заключение, список литературы, приложение.

Титульный лист: содержит название организации-исполнителя, утверждение отчета, заверенное подписью руководителя учреждения и печатью организации, название отчета, должность, фамилию, имя, отчество и подпись руководителя проведенных исследований.

Список исполнителей: ответственный исполнитель, исполнители — фамилия, имя, отчество, должность, степень, звание, подпись.

Оглавление: перечень разделов с указанием страниц отчета. Введение: цели и задачи исследования.

Обзор литературы: информация об оригинальном фармакологическом веществе или литературные сведения о воспроизведенном препарате.

Материалы и методы: физико-химическая характеристика субстанции и лекарственной формы, их соответствие проекту нормативной документации (ФСП, ФС или количественный и качественный состав лекарственной формы воспроизведенного ЛП, серия, соответствие проекту ФСП).

Характеристика использованных лабораторных животных (источник получения, масса, возраст, пол, условия содержания).

Схема исследования, обоснование выбранных доз.

Описание методов исследования и метода статистической обработки данных. Результаты проведенных исследований: описание острой токсичности, кумуляции и

хронической токсичности в соответствии с полученными достоверными изменениями изученных показателей и результатами патоморфологических исследований, способ эвтаназии животных.

Заключение: краткое обсуждение полученных результатов, прогноз возможных побочных эффектов, рекомендуемые ограничения или необходимый контроль при проведении КИ.

20