3 курс / Фармакология / Диссертация_Гильдеева_Г_Н_Формирование_междисциплинарного_подхода

152

проявляют антителозависимую клеточную цитотоксичность таргетных клеток линии Raji, гиперэкспрессирующих CD20 рецептор.

Специфический лизис таргетных клеток проявляемый препаратом Деплера серий (010614, 020614 и 030614) в расчете от полумаксимальной эффективной концентрации препаратов Мабтера® (серии Н0143, Н0686 и Н0142) составляет

98,11% (при среднем значении EC50 0,026±0,001 nM).

Данные значения входят в рекомендуемый диапазон 80-125% от среднего значения активности оригинального препарата (для рекомендуемого диапазона

EC50 составляет 0,021 – 0,032 nM) (табл. 3.3).

Таблица 3.3 - Сравнительные значения уровня активности для серий

оригинального и испытуемого препаратов в тесте АЗКЦ

Примечание: * для расчета уровня специфического лизиса использовали формулу: x100%, где (S) – среднее значение EC50 для различных серий

153

оригинального препарата Мабтера®, а (T) – среднее значение EC50 для серий препарата Деплера.

3.3.3. Связывание с Fc-рецепторами (поверхностный плазмонный резонанс)

Средние значения данных активности связывания препаратов GNR-006 и

Мабтера с рецепторами FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIb, FcγRIIIb и FcRn в

сравнении со стандартом, измеренные с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса представлены в таблице 3.4.

Таблица 3.4 - Средние значения данных активности связывания препаратов

GNR-006 и Мабтера с рецепторами FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIb, FcγRIIIb

и FcRn в сравнении со стандартом

154

Полученные значения относительной активности связывания препаратов Деплера, (серия 010614, серия 020614, серия 030614) входят в рекомендуемый диапазон 80-125% значений относительной активности препаратов Мабтера®

(серия Н0142, Н0143 и серия Н0686).

3.3.4. Цитотоксическое действие препаратов гемцитабина

Влияние Гемзара и Гемцитеры на клетки MCF-7

Так как гемцитабин показан для лечения рака молочной железы,

целесообразно использовать культуру клеток этого опухолевого заболевания — МСБ-7 — для оценки сравнительной цитостатической активности I и II.

Полученные данные представлены в табл. 3.5 как в единицах оптической плотности, так и в процентах от соответствующего контроля.

Таблица 3.5 - Жизнеспособность клеток MCF-7 в присутствии Гемзара и

Ггемцитеры (в % от контроля)

Установлено, что при 48-часовой инкубации Гемзар и Гемцитера достоверно снижают жизнеспособность клеток MCF-7 в концентрациях 1-4 мг/мл до 51,2 - 52,0 % соответственно и не влияют на их жизнеспособность в концентрациях менее 1 мг/мл.

Достоверных различий в цитостатической активности препаратов при р =

0,05 не обнаружено. Концентрация 4,0 мг/мл вероятно близка к предельной для данных экспериментов, так как концентрация 40 мг/мл (предельная растворимость для I и II согласно инструкции к препаратам), из которой путем разведения получали концентрацию 4 мг/мл в культуре клеток, вызывает

155

изменения кислотности среды инкубации, которая может влиять на жизнеспособность культуры.

Влияние Гемзара и Гемцитеры на клетки НеLа

Учитывая широкое использование противоопухолевых средств, в частности

III, для терапии рака шейки матки, в качестве объекта дальнейших исследований была выбрана культура клеток HeLa, которую применяют для оценки эффективности противоопухолевых средств.

Инкубация клеток с исследуемыми препаратами проводилась в течение 48

ч. Результаты представлены в табл. 3.6 как в единицах оптической плотности, так и в процентах от соответствующего контроля.

Таблица 3.6 - Жизнеспособность клеток культуры HeLa в присутствии

Гемзара и Гемцитеры (в % от контроля)

Установлено, что жизнеспособность клеток HeLa достоверно снижается под действием исследуемых средств, начиная с концентрации 2 мг/мл (на 27 %).

Максимальный ингибирующий эффект наблюдается при концентрации I и II 8

мг/мл — снижение жизнеспособности составляет в среднем 60 %. В концентра-

ции 4 мг/мл препараты снижают жизнеспособность клеток на 30 % (жизнеспособность клеток MCF-7 снижалась в данной концентрации на 50 %).

Можно полагать, что IC50 для клеток HeLa близка к 8 мг/мл. Таким образом,

клетки HeLa менее чувствительны к действию исследуемых соединений, чем клетки MCF-7. Достоверных различий в действии Гемзара и Гемцитабина на данную клеточную культуру также не выявлено.

Жизнеспособность нормальных фибробластов кожи крыс в присутствии Гемзара и Гемцитеры

156

При лучевой терапии опухолевых заболеваний, например рака легкого,

побочным эффектом является развитие пневмосклероза, разрастание соединительной ткани является нежелательным эффектом и при лечении многих других новообразований. Результаты исследования представлены в табл. 3.7 как в единицах оптической плотности, так и в процентах от соответствующего контроля.

Таблица 3.7 - Жизнеспособность клеток кожных фибробластов в присутствии

Гемзара и Гемцитеры

Установлено, что Гемзар и Гемцитера в равной степени оказывают выраженное ингибирующее действие на фибробласты кожи крыс. Достоверное цитостатическое действие проявляется в концентрациях, сходных с таковыми для культуры рака молочной железы MCF-7. Жизнеспособность фибробластов снижается в среднем на 30 % в дозе 2 мг/мл. Снижение жизнеспособности при концентрации I и II 4 мг/мл достигает 60 %, а при концентрации 8 мг/мл наблюдается 90 % ингибирование жизнеспособности фибробластов.

Таким образом, на основании проведенного исследования влияния Гемзара и Гемцитеры на жизнеспособность 3 клеточных культур: 2 опухолевых — рака молочной железы и шейки матки — и нормальных фибробластов, установлено,

что данные препараты обладают одинаковой цитостатической активностью. По чувствительности к ним исследуемые культуры можно расположить в следующем ряду: HeLa < MCF-7- < фибробласты [27].

157

3.4.Выводы по главе

Внастоящей работе с помощью методов in vitro показано функциональное сходство лекарственного препарата Деплера и зарегистрированного в РФ лекарственного препарата Мабтера®, а также лекарственного препарата Гемцитера и зарегистрированного в РФ лекарственного препарата Гемзар®, что позволяет сделать предварительное заключение об их сопоставимой эффективности. Разработанные методики целесообразно применять в предрегистрационных исследованиях воспроизводимых ЛС. Методы актуальны и соответствуют основным требованиям альтернативной концепии Replacement (замена) – замены исследований in vivo на in vitro. Использование культур клеток позволяет установить характер биологической активности изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне.

Полученные результаты будут использованы для разработки регламентов пилотного и промышленного производства лекарственных препаратов Деплера и Гемцитера, а также для проведения доклинических и последующих клинических исследований препарата. Экономическая и социальная значимость внедрения более доступных, но не уступающих по безопасности,

переносимости и эффективности препаратов ритуксимаба и гемцитабина в настоящее время не вызывает сомнений.

158

ГЛАВА 4. «БИОВЕЙВЕР» КАК АЛЬТЕРНАТИВА ИССЛЕДОВАНИЯМ

БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТИ ВОСПРОИЗВЕДЕННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

ПРЕПАРАТОВ

Обеспечение надежного контроля качества генериков является одной из первостепенных задач фармацевтической промышленности РФ. Согласно законодательству РФ, следующим (после доклинических исследований in vitro или in vivo) этапом подтверждения эффективности и безопасности воспроизведенного ЛП оригинальному или другому препарату сравнения являются проводимые на здоровых добровольцах или пациентах сравнительные клинические исследования или исследования биоэквивалентности. Такие исследования достаточно длительны,

трудоемки и дорогостоящи, требуют решения ряда этических вопросов. В связи с этим, многими ведущими регуляторными агентствами мира по здравоохранению как альтернатива исследованиям биоэквивалентности in vivo, утверждена процедура биовейвер. В соответствие с последней, определение взаимозаменяемости и регистрация воспроизведенных ЛП проводятся на основании биофармацевтических свойств АФС (по БКС) и эквивалентности in vitro.

Классическим тестом, используемым в рамках процедуры «биовейвер» и

определяющим качество генериков, подтверждающим фармацевтическую эквивалентность и позволяющим в определенных условиях предсказать эффективность in vivo, является тест “Растворение”, характеризующий скорость и степень высвобождения АФС из ЛП в стандартных условиях.

Внедрение расширенной процедуры биовейвер, имеющей большое научно-

практическое значение, способствует решению одной из важнейших задач стратегии развития фармацевтической промышленности РФ на период до 2020 г. –

обеспечению импортозамещения ЛП.

159

4.1.Материалы и методы

Изучение сравнительной кинетики растворения проводили в соответствии с требованиями Методических Указаний МЗиСР РФ «Проведение качественных исследований биоэквивалентности лекарственных средств», ОФС 42-0003-04 [111].

Препараты леветирацетама

Исследуемый препарат: Леветирацетам таблетки, покрытые пленочной оболочкой, 500 мг (производитель: Ривофарм СА, Швейцария).

Референтный препарат (препарат сравнения): Кеппра® таблетки,

покрытые пленочной оболочкой, 500 мг (производитель: ЮСБ Фарма СА,

Бельгия).

Условия растворения

Для получения статистически достоверных результатов исследование проводили 12 раз для каждого препарата в каждой среде растворения.

Количественное определение содержания леветирацетама, перешедшее в раствор провели методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(ВЭЖХ).

Приготовление растворов

Реактивы

Аммония ацетат, ч.д.а. (Россия); динатрия гидрофосфат, ч.д.а. (Россия); лимонная кислота, Fluka; натрия хлорид, ч.д.а. (Россия); натрия гидроксид, Sigma Aldrich; уксусная кислота ледяная, осч. (Россия); хлористоводородная кислота, концентрированная, ч.д.а. (Россия); орто-фосфорная кислота, осч.12-3 (Россия); ацетонитрил, HPLC far UV/Gradient grade (J.T.Baker); вода для ВЭЖХ, gradient HPLC grade (Scharlau); рабочий стандартный образец леветирацетама; вода очищенная.

Приготовление сред растворения

Солянокислый буфер, pH 1.2

Приготовление раствора А (0.2М раствор хлористоводородной кислоты): 17.2 мл хлористоводородной кислоты концентрированной поместили в мерную колбу вместимостью 1000 мл, осторожно довели объем раствора до метки и перемешали.

Приготовление раствора В (0.2М раствор натрия хлорида): 11.7 г натрия хлорида поместили в мерную колбу вместимостью 1000 мл, перемешали и довели