3 курс / Фармакология / Диссертация_Гильдеева_Г_Н_Формирование_междисциплинарного_подхода

191

этилацетат, однако он дает не очень высокую степень извлечения хлормадинона ацетата и достаточно высокий фон в области выхода пика хлормадинона.

Перепробовав несколько различных комбинаций растворителей для экстракции было решено остановиться на комбинации 50% диэтиловый эфир/ 50% гексан.

Этот экстрагент использовали и на первом этапе экстракции (для увеличения степени извлечения этинилэстрадиола плазму крови подкисляли соляной кислотой), и на втором (мешающие продукты гидролиза дериватизующего реагента на данном этапе удерживались в водной фазе благодаря использованию карбонатного буфера). Таким образом, на основе имеющихся в литературе данных, был разработан метод определения хлормадинона ацетата и этинилэстрадиола в плазме крови добровольцев, удовлетворяющий требованиям протокола исследования и валидированный в соответствии с руководством FDA

для предприятий «Bioanalytical Method Validation» (Май 2001 г.) и руководством

EMEA «Guideline on bioanalytical method validation» (Июль 2011 г.).

Стандарты

В данной методике для приготовления калибровочных стандартов и образцов контроля качества была использована субстанции хлормадинона ацетата

("CHEMO", Code: 101187) и этинилэстрадиола ("CHEMO", Code: 100697),

полученные от Спонсора исследования.

Биологическая матрица

Матрицей для приготовления калибровочных стандартов и образцов контроля качества служила плазма крови человека, полученная от здоровых добровольцев мужского пола (бланковая плазма), чтобы исключить возможное влияние эндогенных женских половых гормонов близкой структуры.

Химические реактивы

1. Ацетонитрил для ВЭЖХ, >99.9, вода для ВЭЖХ, муравьиная кислота, >88%, метанол для ВЭЖХ, >99.9%, фенацетин, >98%, ацетон «ОСЧ 9-5», гексан

«ХЧ», диэтиловый эфир «ЧДА», дансилхлорид, кислота соляная «ОСЧ».

Оборудование

192

1. Жидкостной хроматограф Shimadzu в составе: дегазатор DGU-20A5R;

градиентные насосы LC-30AD; автосемплер SIL-30AC; термостатируемый колоночный блок CTO-20AC;

2. Масс-спектрометр с источником химической ионизации при атмосферном давлении и тройным квадрупольным масс-анализатором AB Sciex

QTrap 4500;

3.Весы лабораторные электронные OHAUS Explorer EX324;

4.Автоматические дозаторы BiohitProline:

5.Смеситель лабораторный ELMI Vortex V-3;

6.Центрифуга Eppendorf 5415D;

7.Центрифуга ELMI CM-6MT.8. Водяная баня

8.Центрифужный испаритель Eppendorf 5301 Concentrator.

Приготовление раствора разбавителя, экстрагента и дериватизующего реагента

Для приготовления раствора разбавителя в конической колбе смешивали 50

мл воды и 50 мл ацетонитрила. Хранили при +4°С в течение недели. Экстрагент готовили смешением одинаковых объёмов гексана и диэтилового эфира непосредственно перед проведением процедуры экстракции. Дериватизующий реагент готовили следующим образом: взвешивали 50 мг дансилхлорида,

переносили в мерную колбу на 50 мл и добавляли ацетон до метки. Тщательно перемешивали и получали раствор дансилхлорида с концентрацией 1 мг/мл.

Приготовление стандартных растворов вещества и внутреннего стандарта

Для приготовления стандартного раствора хлормадинона ацетата с концентрацией 1,00 мг/мл взвесили 25,0 мг стандартного образца хлормадинона ацетата (точная навеска), поместили в мерную колбу вместимостью 25 мл и довели до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор хранили в течение месяца в холодильнике при +4°С.

193

Для приготовления стандартного раствора этинилэстрадиола с концентрацией 1,00 мг/мл взвесили 10,0 мг стандартного образца хлормадинона ацетата (точная навеска), поместили в мерную колбу вместимостью 10 мл и довели до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор хранили в течение месяца в холодильнике при +4°С.

Для приготовления стандартного раствора внутреннего стандарта фенацетина (IS) взвесили 10 мг фенацетина (точная навеска), поместили в мерную колбу вместимостью 10 мл и довели до метки метанолом (концентрация 1 мг/мл). 100 мкл полученного раствора стандартного образца фенацетина поместили в мерную колбу вместимостью 10 мл и довели до метки метанолом. Полученная концентрация промежуточного стандартного раствора фенацетина составила 10,0

мкг/мл. Затем 1,00 мл полученного промежуточного раствора поместили в мерную колбу вместимостью 10 мл и довели до метки метанолом, финальная концентрация промежуточного стандартного раствора фенацетина составила 1,00

мкг/мл. Стандартный раствор внутреннего стандарта хранили в холодильнике при

+4°С в течение двух недель.

Приготовление сток-растворов стандартов

Для каждой аналитической серии готовили свежие сток-растворы стандартов. Конечная концентрация сток-растворов стандартов хлормадинона ацетата составила: 10,0 мкг/мл, 1,00 мкг/мл, 500 нг/мл, 200 нг/мл, 100 нг/мл, 50,0

нг/мл, 20,0 нг/мл, 10,0 нг/мл, 5,00 нг/мл, 2,00 нг/мл. Конечная концентрация сток-

растворов стандартов этинилэстрадиола составила: 10,0 мкг/мл, 100 нг/мл, 50,0

нг/мл, 20,0 нг/мл, 5,00 нг/мл, 2,00 нг/мл, 1,00 нг/мл, 500 пг/мл, 200 пг/мл, 100

пг/мл.

Приготовление калибровочных стандартов

Для приготовления калибровочных стандартов для валидации к 1,00 мл бланковой плазмы добавляли по 10 мкл сток-растворов с известной концентрацией хлормадинона ацетата: 50 пг/мл; 100 пг/мл; 200 пг/мл 500 пг/мл,

194

1000 пг/мл; 2000 пг/мл; 5000 пг/мл; 10000 пг/мл; и этинилэстрадиола: 2 пг/мл; 5

пг/мл; 10 пг/мл; 20 пг/мл; 50 пг/мл; 100 пг/мл; 200 пг/мл; 500 пг/мл.

Приготовление подвижной фазы (элюент А)

0,1% раствор муравьиной кислоты (рН=4,0): в мерную колбу на 1 литр помещали 1 мл муравьиной кислоты, доводили водой для ВЭЖХ до метки и перемешивали.

Приготовление образцов контроля качества

Для приготовления образцов контроля качества для валидации, валидации к

1,00 мл бланковой плазмы добавляли по 10 мкл сток-растворов с известной концентрацией хлормадинона ацетата: 200 пг/мл; 5000 пг/мл; 10000 пг/мл;

этинилэстрадиола: 2 пг/мл; 200 пг/мл; 500 пг/мл.

Пробоподготовка

Для повышения чувствительности определения этинилэстрадиола использовали его дериватизацию дансилхлоридом для введения легкоионизующегося фрагмента третичного амина. При этом этинилэстрадиол переходит в дансилэтинилэстрадиол, а хлормадинона ацетат остается в неизменном виде. Совместную экстракцию хлормадинона ацетата и этинилэстрадиола из плазмы крови проводили следующим образом: плазму крови размораживали при комнатной температуре, центрифугировали в течение 5 минут при 3200 об/мин, 1000 мкл плазмы крови переносили в чистые стеклянные пробирки объёмом 15 мл, добавляли по 10 мкл раствора внутреннего стандарта в метаноле (концентрация 1,00 мкг/мл) и 100 мкл 1М соляной кислоты, встряхивали на вортексе, далее добавляли по 4 мл экстрагента (50/50 гексан/диэтиловый эфир),

перемешивали на вортексе в течение 3 минут. Затем пробы замораживали в холодильнике при -80°С, органический слой переносили в стеклянные виалы объёмом 5 мл и выпаривали растворитель досуха в токе азота при комнатной температуре. После этого в виалы добавляли по 100 мкл раствора карбоната натрия (4,0 г/л) и 100 мкл раствора дансилхлорида в ацетоне (1 мг/мл), ставили в водяную баню при 60°С на полчаса, затем прибавляли по 2 мл экстрагента (50/50

195

гексан/диэтиловый эфир), перемешивали на вортексе в течение 2 минут. Пробы замораживали в холодильнике при -80°С, органический слой переносили в стеклянные виалы объёмом 2 мл и выпаривали растворитель досуха в центрифужном испарителе при 30°C. После этого в виалы добавляли по 300 мкл разбавителя (50%-ный водный ацетонитрил), встряхивали на вортексе в течение 1

минуты, переносили в микропробирки Eppendorf и центрифугировали в течение

10 минут при 13200 rpm. По 250 мкл упернатанта переносили в стеклянные виалы со стеклянными вставками.

Хроматографический анализ Условия хроматографического разделения

196

Раствор для промывки иглы: 30% вода/35% ацетонитрил/35% метанол

Хлормадинона ацетат:

Позитивная ионизация(MRM (E+)), m/z 405,2- >345,0

Дансилэтинилэстрадиол:

Параметры масс-детектора: Позитивная ионизация(MRM (E+)), m/z 530,2- >171,1

Фенацетин:

Позитивная ионизация(MRM (E+)), m/z 180,0- >138,0

Время регистрации

7 минут

хроматограммы:

Количественное определение концентрации определяемого вещества

Использовалось автоматическое интегрирование хроматограмм с помощью программного обеспечения фирмы AB Sciex Analyst 1.6.1 build 5341. Для количественного определения использовался метод градуировочного графика с весовым коэффициентом 1/х. В качестве параметра бралось соотношение площадей пика аналита и внутреннего стандарта.

Препараты митотана На основе имеющихся в литературе данных впервые был разработан новый

чувствительный и селективный метод определения митотана в плазме крови добровольцев методом ГХ-МС, валидированный в соответствии с руководством

FDA для предприятий «Bioanalytical Method Validation» (Май 2001 г.) и

руководством EMEA «Guideline on bioanalytical method validation» (Июль 2011 г.).

Стандарты

В данной методике для приготовления калибровочных стандартов и образцов контроля качества была использована субстанция митотана (ЗАО

«ОХФК», Россия, серия 160).

197

Биологическая матрица

Матрицей для приготовления калибровочных стандартов и образцов контроля качества служила плазма крови человека (антикоагулянт Li-Heparine),

полученная от здоровых добровольцев.

Химические реактивы

Метанол для ВЭЖХ, J.T. Baker, Нидерланды; ацетон, Химмед, Россия;

гексан для ВЭЖХ, J.T. Baker, Нидерланды.

Оборудование

1.Газовый хроматограф Shimadzu QP-2010Plus с масс-спектрометрическим детектором Shimadzu GCMS-2010Ultra;

2.Весы лабораторные электронные OHAUS Explorer EX324;

3.Автоматические дозаторы: Sartorius ИН-019, 10-50 мкл; Sartorius ИН-021, 100-1000 мкл; Sartorius ИН-024, 1000-5000 мкл.

4.Смеситель лабораторный Vortex V-3;

5.Орбитальный шейкер ELMI S-3.10M

Приготовление стандартного раствора вещества и внутреннего стандарта

Для приготовления стандартного раствора митотана с концентрацией 1

мг/мл взвесили 10 мг стандартного образца митотана (точная навеска), поместили во флакон и добавили 10 мл метанола (конечная концентрация 10 мг/мл). Для приготовления стандартного раствора внутреннего стандарта 4-4-ДДТ (IS)

взвесили 10 мг 4-4-ДДТ (точная навеска), поместили в мерную колбу вместимостью 100 мл и довели до метки метанолом. Полученная концентрация стандартного раствора 4-4-ДДТ составила 100 мкг/мл.

Приготовление калибровочных растворов

198

Сток-растворы готовили методом последовательного разбавления согласно

схеме:

Митотан

Приготовление калибровочных стандартов

Для проведения валидации методики использовались следующие

калибровочные образцы:

199

Для приготовления калибровочных образцов по 10 мкл калибровочного раствора, содержащего известное количество аналитов добавляли к 190 мкл бланковой плазмы:

Cal1 (10 мкл сток-раствора A); Cal2 (10 мкл сток-раствора C); Cal3 (10 мкл сток-раствора D); Cal4 (10 мкл сток-раствора E); Cal5 (10 мкл сток-раствора F);

Cal6 (10 мкл сток-раствора G); Сal7 (10 мкл сток-раствора I); Cal8 (10 мкл сток-

раствора J); Cal9 (10 мкл сток-раствора K); Cal10 (10 мкл сток-раствора M).

Калибровочные стандарты готовились в день анализа аналитической серии.

Приготовление образцов контроля качества.

Для проведения валидации методики использовались следующие образцы контроля качества:

Для приготовления образцов контроля качества 10 мкл калибровочного раствора, содержащего известное количество аналитов, добавляли к 190 мкл бланковой плазмы:

QC0 (10 мкл сток-раствора A); QCL (10 мкл сток-раствора B); QCM (10 мкл сток-раствора H); QCH (10 мкл сток-раствора L).

Образцы контроля качества готовились в день анализа аналитической серии.

Пробоподготовка анализируемых проб

Пробоподготовку интактной матрицы без внутреннего стандарта проводили следующим образом: 200 мкл плазмы крови переносили в виалу, добавляли 100

мкл ацетона и перемешивали на шейкере 10 мин при 350 об/мин. Далее добавляли

200

400 мкл гексана и проводили жидкостно-жидкосную экстракцию на шейкере в течении 30 минут при 350 об/мин. Затем 150 мкл верхней органической фазы

(гексан) переносили во вставку, а вставку помещали в виалу. В

хроматографическую систему вводили 2,5 мкл образца.

Пробоподготовку интактной матрицы с внутренним стандартом проводили следующим образом: к 200 мкл плазмы крови добавляли 10 мкл внутреннего стандарта в виале, добавляли 100 мкл ацетона и перемешивали на шейкере 10 мин при 350 об/мин. Далее добавляли 400 мкл гексана и проводили жидкостно-

жидкостную экстракцию на шейкере в течении 30 минут при 350 об/мин. Затем

150 мкл верхней органической фазы (гексан) переносили во вставку, а вставку помещали в виалу. В хроматографическую систему вводили 2,5 мкл образца.

Пробоподготовку образцов контроля качества и калибровочных образцов проводили следующим образом: 190 мкл плазмы крови переносили в виалу,

добавляли 10 мкл калибровочного раствора и 10 мкл внутреннего стандарта.

Затем 100 мкл осаждающего реагента (ацетон), перемешивали на шейкере 10 мин при 350 об/мин. Далее добавляли 400 мкл гексана и проводили жидкостно-

жидкостную экстракцию на шейкере в течении 30 минут при 350 об/мин. Затем

150 мкл верхней органической фазы (гексан) переносили во вставку, а вставку помещали в виалу. В хроматографическую систему вводили 2,5 мкл образца.

Условия хроматографического разделения