3 курс / Фармакология / Диссертация_Гильдеева_Г_Н_Формирование_междисциплинарного_подхода

241

определения точности и достоверности концентрации аналитов в образце определялись в шести повторах. Результаты представлены в таблице 5.13.

Полученные значения удовлетворяют критериям приемлемости.

Таблица 5.13 - Результаты теста на разбавление для митотана

Матричный эффект

Обычно матричный эффект оценивают при сравнении пост-спайков (аналит добавляется после процедуры экстракции) с растворами аналита в чистых растворителях. Однако в данном случае не имелось возможности добавить раствор аналита в экстракт плазмы (газовая хроматография предполагает полное отсутствие следов воды в пробе, а растворить аналит в гексане было невозможно).

В данном исследовании матричный эффект оценивали по анализу 6 повторов QCL

и QCH, приготовленных на плазме из 6 разных источников (таблица 5.14).

Таблица 5.14 - Матричный эффект

242

5.3.Выводы по главе

Разработаны и валидированы новые методики количественного определения воспроизведенных гормональных оральных контрацептивных средств, содержащих в качестве фармацевтической субстанции хлормадинон+этинилэстрадиол, дезогестрел и дезогестрел+этинилэстрадиол.

Методики информативны, воспроизводимы и достаточны для установления фармакокинетических параметров в клинических исследованиях биоэквивалентности.

В Министерство здравоохранения Российской Федерации в установленном порядке были поданы документы с целью получения разрешения на проведение клинических исследований и, после успешного их завершения, оценки результатов на основании подготовленных в соответствии с международными требованиями отчетов. Препараты Ангелетта таблетки, покрытые пленочной оболочкой 2 мг+0,03 мг, Диамилла, таблетки, покрытые пленочной оболочкой 75

мкг и Бенидетта, таблетки, покрытые пленочной оболочкой 150 мкг+30 мкг,

прошли установленную законом процедуру регистрации в РФ с принятием положительного решения о возможности их медицинского применения.

В рамках диссертационной работы была разработана новая методика количественного определения фармакологически активного вещества митотан в плазме крови человека для установления фармакокинетических параметров с целью сравнительного изучения фармакокинетических параметров в составе готовой лекарственной формы.

243

Проведена валидация аналитической методики количественного определения митотана в плазме крови человека методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Нижний предел количественного определения составил 0,1 мкг/мл для митотана. Воспроизводимость,

прецизионность и правильность достигается во всем интервале концентраций.

Анализируемое вещество стабильно при хранении в автосэмплере в течение 72

часов после пробоподготовки, в течение 6 часов при комнатной температуре, а

также после заморозки и последующей разморозки.

244

ГЛАВА 6. ПЕРСПЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

ФАРМАКОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ПРИ

ПЛАНИРОВАНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЭКВИВАЛЕНТНОСТИ

Одним из механизмов, способным оптимизировать процедуру оценки эффективности и безопасности воспроизведенных ЛП в рамках исследований биоэквивалентности, являются фармакогенетические методы. Несмотря на то, что в большинстве случаев исследование биоэквивалентности является рутинным,

тем не менее, правильно спланированное исследование позволяет получить валидные данные и снизить расходы на разработку воспроизведенного препарата.

Межиндивидуальная вариабельность является основным фактором,

влияющим на размер выборки в исследовании биоэквивалентности. К

высоковариабельным ЛС относят некоторые ЛС из группы ингибиторов АПФ,

ингибиторов протеазы ВИЧ-1, ингибиторов обратной транскриптазы,

ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы, бисфосфонаты, агонисты дофаминовых рецепторов, антиагреганты, синтетические андрогены, синтетические аналоги витамина D, аналоги простагландина Е, агонисты гидрокситриптаминовых рецепторов, антиаритмики [267].

Различная скорость метаболизма ЛС, связанная с полиморфизмом генов,

вносит большой вклад в их вариабельность. Генотипирование и фенотипирование добровольцев до начала исследования позволяет выявить различия в системе метаболизма каждого индивида и предсказать возможную реакцию организма на вводимое ЛС. Однородность исследуемой группы позволяет снизить размер выборки и получить достоверные результаты в исследовании биоэквивалентности.

Нами проведено генотипирование и фенотипирование 20 здоровых добровольцев, которые могли быть включены в исследование биоэквивалентности. В качестве воспроизведенного препарата, метаболизм

245

которого в значительной мере зависит от индивидуальных особенностей ферментативной системы организма, был выбран небиволол.

Небиволол активно метаболизируется, частично с образованием активных гидроксиметаболитов. Метаболизм небиволола происходит путем алициклического и ароматического гидроксилирования, N-деалкилирования и глюкуронирования, кроме того, образуются глюкурониды гидроксиметаболитов.

Скорость метаболизма небиволола путем ароматического гидроксилирования генетически определена окислительным полиморфизмом и зависит от CYP2D6. У

лиц с быстрым метаболизмом T1/2 небиволола из плазмы составляет в среднем 10

ч, у лиц с медленным метаболизмом - в 3-5 раз выше.

У лиц с быстрым метаболизмом значения T1/2 гидроксиметаболитов из плазмы составляют в среднем 24 ч, у лиц с медленным метаболизмом - в 2 раза выше. Литературные данные [322] однозначно указывают на значительные различия в фармакокинетических параметрах «медленных» и «быстрых» метаболизаторов при проведении исследования биоэквивалентности, что может приводить к получению невалидных данных в случае, если перед началом исследования не было проведено предварительное фармакогенетическое тестирование, или если размер выборки был спланирован без учета высокой межиндивидуальной вариабельности небиволола.

6.1.Материалы и методы

Генетическое исследование проводилось по специально подобранным панелям - наборам полиморфизмов, ассоциированных с определенным влиянием на метаболизм ЛС. Детекция генетических полиморфизмов проводилась с помощью методики пиросеквенирования. Исследовался полиморфизм генов двух изоферментов CYP2С19 и CYP2D6, участвующих в метаболизме 80% ЛС.

Для исследования применялся прибор для пиросеквенирования

PyroMarkQ24, набор реагентов «АмплиСенс® Пироскрин», профиль «ФАРМА-

246

скрин-1б» – профиль генетического исследования «I фаза биотрансформации, профиль 1», предназначена для выявления генетических полиморфизмов в генах, влияющих на индивидуальные особенности фармакологического ответа на применение антиагрегантных лекарственные, антигипертензивных, психотропных, антиаритмических и противоязвенных ЛС.

В качестве биологического материала использовалась цельная кровь (ЭДТА). Порядок проведения исследования:

1.Наработка ампликона (выделение ДНК (1 ч), постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) (2 ч));

2.Пробоподготовка (иммобилизация ПЦР-продуктав шейкере (0.5 ч), получение одноцепочечной ДНК в станции для пробоподготовки (10 мин), отжиг секвенирующего праймера в термостате (7 мин));

3.Детекция нуклеотидной последовательности (секвенирование (15 мин), анализ результатов).

Оценку активности изофермента CYP2D6 в ходе фенотипирования проводили с помощью определения в плазме крови здоровых добровольцев (предполагаемых участников исследования биоэквивалентности препаратов небиволола) эндогенного пинолина и его метаболита 6-гидрокси-1,2,3,4-

тетрагидро-бета-карболина. Методика определения в плазме крови пинолина и его метаболита была разработана в ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России в лаборатории клинической фармакологии [10].

Хроматограф: Agilent 1290 Infinity; Предколонка: Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 12,5 x 2,1 мм, 5 мкм (кат. № 821125-936); Колонка: Agilent Zorbax Eclipce Plus C18 RRHD 100 x 2,1 мм, 1,8 мкм (кат. № 959758-902K); Температура колонки: (50

± 1) ºС; Скорость потока: 0,4 мл/мин; Детектирование: МС/МС, MRM-переходы для пинолина 203,2 m/z → 174,0 m/z, для 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-

карболина 189,2 m/z → 160,0 m/z, для галантамина 288,3 m/z → 213,0 m/z; Метод ионизации: электроспрей (ESI) в положительной полярности; Объем пробы: 5

мкл. Ориентировочные времена удерживания в плазме крови: 6-гидрокси-1,2,3,4-

247

тетрагидро-β-карболин – около 1,1 мин; пинолин – около 5,0 мин; галантамин – около 2,4 мин. Ориентировочные времена удерживания в моче: 6-гидрокси- 1,2,3,4-тетрагидро-β-карболин – около 1,1 мин; пинолин – около 5,0 мин;

галантамин – около 2,4 мин. Время хроматографирования: 14 мин. Подвижная фаза: Элюент А: 5 мМ аммония формиата и 0,01 % муравьиной кислоты в воде.

Элюент B: 0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле.

Методика

Систему ВЭЖХ стабилизировали в условиях начального градиента (элюент А : элюент В = 95 % : 5 %) в течение 15 мин.

Градиентная программа:

В качестве метода количественного определения был выбран метод калибровки с внутренним стандартом. Для построения калибровочного графика были приготовлены растворы в плазме с добавлением известного количества стандартных образцов пинолина, его метаболита и внутреннего стандарта галантамина. Сначала готовили стандартные растворы пинолина, его метаболита и галантамина в метаноле. Затем, путем разведения этих растворов в плазме,

получали серию калибровочных растворов. Концентрации калибровочных растворов были следующие – 250 пг/мл, 375 пг/мл, 500 пг/мл, 750 пг/мл, 1000

пг/мл, 1250 пг/мл и 1500 пг/мл. Концентрация внутреннего стандарта галантамина составила 20 нг/мл. После хроматографирования полученных растворов строили калибровочные графики зависимости отношения площадей исследуемого

248

вещества к внутреннему стандарту (ось X) от известных концентраций (ось Y), по которым определяли концентрации пинолина и 6-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-

карболина.

Методика была валидирована на основе «Руководства по экспертизе лекарственных средств» под редакцией проф. А.Н. Миронова [119], а также Руководств FDA [251] и EMA [253] по показателям линейности, селективности,

правильности, прецизионности и пределу количественного определения. Далее рассчитывался метаболический индекс путем деления концентрации метаболита на концентрацию пинолина.

6.2.Результаты собственных исследований

6.2.1.Генотипированние

Ген CYP2С19 (CYTOCHROMEP450, SUBFAMILYIIC, POLYPEPTIDE 19) (MIM 124020)

Название: цитохром Р450 2С19. Расположение гена: Хромосома 10 локус

10q23.33. Исследование данного полиморфизма показано перед применением НПВП, ингибиторов протонной помпы, пролекарств, активирующихся с участием изофермента CYP2C19.

Характеристика гена и возможное влияние на метаболизм и эффективность ЛС

Ген кодирует цитохром Р450 2С19, монооксигеназу печени, который является ферментом первой фазы детоксикации ксенобиотиков и отвечает за метаболизм некоторых ЛС (в т.ч. нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) и ингибиторов протонной помпы) и активацию пролекарств

(клопидогрел).

При аллелях *2 и *3 активность фермента снижена, что приводит к замедлению метаболизма вышеуказанных ЛС. Наличие этих аллелей повышает

249

риск развития нежелательных лекарственных реакций (НЛР) при приеме стандартных доз вышеуказанных ЛС, что может потребовать снижения дозы. В

случае применения пролекарств, которые активируются посредством изофермента CYP2С19, при аллелях *2 и *3 может потребоваться увеличение дозы для достижения терапевтического эффекта.

Частота встречаемости мутантного варианта гена: 20% (аллель *2) и 2% (аллель *3)

Исследованные полиморфизмы

1. 681 G>A (CYP2C19*2) (rs4244285). Аллель риска A, защитный аллель G.

Генотипы АА и AG снижают метаболизм некоторых лекарств. Пациенты с таким генотипом, принимающие клопидогрел, имеют меньший эффект и повышенный риск развития сердечно-сосудистых осложнений. Генотип GG – норма.

2. 636 G>A(CYP2C19*3)(rs4986893). Аллель риска А, защитный аллель G.

При генотипах АА и АG в данном полиморфизме нарушен метаболизм таких ЛС как клопидогрел, мефенитоин, прогуанил, омепразол, эзомепразол и лансопразол.

Генотип GG – норма.

3.806 С>Т(CYP2C19*17) (rs12248560). Аллель риска Т, защитный аллель С.

Уносителей генотипа СТ и ТТ отмечается ультрабыстрый метаболизм ЛС. У них отмечается сниженный эффект ингибиторов протонной помпы (в т.ч. омепразол)

и антидепрессантов.

CYP2D6 (CYTOCHROMEP450, SUBFAMILYIID, POLYPEPTIDE 6) (MIM 124030)

Название: цитохром Р4502D6. Расположение гена: хромосома 22 локус

22q13.2. Исследование данного полиморфизма показано перед применением антигипертензивных, психотропных и антиаритмических ЛС.

Характеристика гена и возможное влияние на метаболизм и эффективность ЛС

Ген кодирует цитохром Р4502D6, монооксигеназу печени, который является ферментом первой фазы детоксикации ксенобиотиков и отвечает за метаболизм

250

20% лекарств, в т.ч. антиаритмиков, антигипертензивных и психотропных ЛС, а

также участвует в синтезе холестерина и других липидов.

При аллелях *3, *4 и *6 активность фермента снижена, а при делеции гена

(аллель *5) вообще не продуцируется, что приводит к замедлению метаболизма вышеуказанных ЛС. При дупликации гена (аллель *1xN) продукция фермента повышена, и скорость метаболизма ЛС увеличивается.

Наличие аллелей *3, *4, *5 и *6 повышает риск развития НЛР при приеме стандартных доз некоторых антигипертензивных (альфа- и бета-адреноблокаторы,

блокаторы «медленных» кальциевых каналов и ингибиторы АПФ), психотропных

(антидепрессанты, нейролептики, противосудорожные ЛС) и антиаритмиков, что может потребовать снижения дозы вышеуказанных ЛС.

При аллеле *1xN может наблюдаться низкая эффективность вышеуказанных ЛС, что зачастую требует увеличение дозы для достижения терапевтического эффекта. Частота встречаемости мутантного варианта гена: 1- 21%.

Распределение аллелей CYP2D6 в российской популяции таково, что 5,9%

населения имеют медленно функционирующий фермент (т.е. являются медленными метаболизаторами), 3,4% являются обладателями избыточно функционирующего фермента (быстрые метаболизаторы). Именно поэтому можно наблюдать пациентов, у которых наблюдается выраженный клинический эффект на малые дозы ЛС, метаболизирующегося посредством CYP2D6, или,

напротив, тех, у кого сложно достичь желаемого эффекта, применяя большие дозы.

Исследованные полиморфизмы

1. 2549 delA (CYP2D6*3) (rs35742686). Аллель риска del, защитный аллель А. Генотипы с мутациями в данном полиморфизме: А/del, del/del демонстрируют снижение активности фермента, и, соответственно, повышение частоты побочных эффектов лС.