51
ограничено подвижные (29% и 28%), и неподвижные (70,9% и 72%). У больных наблюдались опухолевые конгломераты в большой сальник (82,2% и 90%), задний свод малого таза (85,4% и 78%).
Таблица 2.10. - Характеристика локального статуса больных РЯ до начало лечения
|
Локальный статус |
Количество больных, получавших |
||||||
|
|
|
полихимиотерапию |
аутогемохимиоте- |
||||
|
|
|
рапию по схеме АР |
|||||
|
|
|
|
(n=62) |
||||
|
|
|
|
|
(n=50) |
|||
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
абс. |
|
% |
абс. |
|
% |
Размеры опухолевого |
до 5 см |
10 |
|
16,1 |
8 |
|
16 |
|
образования |
|
от 5 до 10 см |
34 |
|
54,8 |
29 |
|
58 |
|
|
Более 10 см |
18 |
|
29 |
13 |
|
26 |
Подвижность |
|
Неподвижные |
44 |
|
70,9 |
36 |
|
72 |
образования |
|
Ограниченно подвижные |
18 |
|
29 |
14 |
|
28 |
|
|
Подвижные |
0 |
|
0 |
0 |
|
|
Метастазы в задний свод |
53 |
|
85,4 |
44 |
|
88 |
||
Метастазы в паховые лимфоузлы |
1,6 |
|
2,0 |
0 |
|
0 |
||
Метастазы в большой сальник |
51 |
|
82,2 |
45 |
|
90 |
||
Плеврит |
|
|
16 |
|
25,8 |
11 |
|
22 |
В результате анализа данных локального статуса очевидно все больные на момент постановки диагноза находились в неоперабельном состоянии.
2.3. Методика аутогемохимиотерапии
Больным раком яичников 2-й группы проводилась лечение методом аутогемохимиотерапии. В условиях асептики и антисептики производился забор аутокрови из периферической вены больного в объеме 300 мл в стерильный гемакон с 50 мл глюгицира. Полученная кровь распределялась по двум гемаконам,
соединенным между собой трубкой, после этого в каждый гемакон вводились химиопрепараты в соответствующих дозировках. В течение 40 мин. при температуре 37ºC осуществлялась экспозиция в термостате, далее проводилась внутривенно капельная реинфузия аутокрови с химиопрепаратами. В лечении использовались химиопрепараты в разовой дозировке: цисплатин 75 мг/м2 и
доксорубицин 50 мг/м2. Введение химиопрепаратов осуществлялось двумя курсами с интервалом в 21 день.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
52
2.4. Дизайн исследования
Во время лечения на 3-й и 14-й день после введения химиопрепаратов проводился общий анализ крови, биохимическое исследование крови,
коагулограммы, общий анализ мочи, оценивалось соматическое состояние больного, степень регрессии опухоли, возможность оперативного лечения,
определялись побочные действия АГХТ, отслеживалось появление локальных рецидивов и отдаленных метастазов (рис. 1). После выписки все больные находились под строгим динамическим наблюдением.
Первичный пациент с верифицированным раком яичников
III-IVстадии
Неоадъювантная
химиотерапия по схеме АР
Пациент на 3-й день после 1-го курса ПХТ/АГХТ
Пациент на 14-й день после 1-го курса ПХТ/АГХТ
Пациент на 3-й день после 2-го курса ПХТ/АГХТ
Пациент на 14-й день после 2-го курса ПХТ/АГХТ
Исследование
крови
Оценка качества жизни на фоне лечения (опросник
EORTC-QLQ-C30)
Изучение ответа опухоли на лечение (RECIST, CRS), оценка токсичности химиотерапии (СТСАЕ v.5), безрецидивной выживаемости
Определение
функциональной
активности
нейтрофильных
лейкоцитов
Изучение активности перекисного окисления липидов (МДА, ДК, КД,
ОШ), ОМБ (λ=346, 370, 430, 530нм) и
антиоксидантной системы (СОД,
каталаза, ГТ),
Определение уровней про-, противовоспалительных цитокинов: IL-1β, IL-6, IL-10, IL-18, IL-1RA, TNF-α
Рисунок. 1. Схема проведения исследования.
53
2.5. Цитологические исследования
В ходе исследования оценивалась функциональная активность нейтрофильных лейкоцитов. Нейтрофилы выделялись из венозной крови путем центрифугирования на двойном градиенте фиколл-урографин (ƍ=1,117 и 1,077
г/мл). Определяли абсолютное и относительное количество Нф.
Цитохимическое определение активности МПО Нф проводили по методу Гренхема – Кнолля (1966). Мазки фиксировали в 4% формалиново-спиртовом растворе 30 секунд. В темном месте с высокой влажностью на полученные мазки наносили инкубационную среду, состоящая из 250 мг бинзидина, растворенного в
6 мл спирта 96° и 4 мл воды с добавлением 0,02 мл 3% перекиси водорода на 10
минут. Докрашивали цитоплазму 0,5% спиртовым раствором эозина в течение 10
минут, а ядра – 0,5% спиртовым раствором метиленового синего (15 мин).
Промывали проточной водой в течение 10 секунд и высушивали на воздухе.
Фермент образовывался в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул.
Оценка активности нейтрофилов определялась по спонтанному варианту НСТ-теста. Метод основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия (НСТ) в нерастворимый диформазан. Высушенные мазки помещали в емкость с краской-фиксатором Мая
– Грюнвальда на 3-5 мин. Далее мазки помещали в кювету с разведенным 1:10
раствором красителя Романовского на 20-30 минут. Под проточной водой мазки промывали, на них в темном пространстве наносили раствор тетразолия нитросинего с концентрацией 1 мг/мл на 5-7 минут и снова промывали.
Образовывались зерна формазана синего цвета. Показатели определяли в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Анализ показателей оценивали до ХТ и после нее на 3-й и 14-й дни. Для сравнения количественных переменных
(M±m), соответствующих нормальному распределению, использовали критерий Стьюдента.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
54
2.6. Биохимическое исследование
Для биохимического исследования использовалась стабилизированная кровь, которая после центрифугирования 10 минут при 3000 оборотах разделялась на плазму и эритроцитарную массу. Гомогенат опухоли готовился на Tris-HCI-
буфере, pH=7,4.
Методы определения активности ПОЛ
Интенсивность процессов ПОЛ определялась по содержанию продуктов липопероксидации, МДА, ОМБ на стадиях распространенного рака яичников.
Интенсивность липопероксидации в плазме и эритроцитах крови определялась по уровню диеновых конъюгатов (ДК), кетодиенов (КД), оснований Щиффа (ОШ) по интенсивности поглощения при длинах волн 232, 278 и 400 нм в гептановом экстракте (Волчегорский И.А., 1989). В 0,1 мл гемолизата добавлялась смесь изопропилового спирта и гептана в соотношении 1:1, липиды экстрагировались при активном встряхивании в течение 15 мин,
центрифугировались при 7 тыс. об/мин. Зетемвь добавлялась смесь изопропилового спирта и гептана в соотношении 3:5. Затем еще 2 мл 2 M HCl для четкого разделения фаз, и фотометрировалась верхняя гептановая фаза при 232, 278, 400 нм. Результаты выражались в мкмоль/мл.
МДА определялся в тесте с тиобарбитуровой кислотой по методу Л.И.
Андреевой и соавт. (1988). При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид взаимодействует с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы ТБК с максимумом поглощения при 535 нм. Данные показатели исследования приведены в мкмоль/л.
Содержание продуктов ОМБ оценивалось при 346, 370, 430 и 530 нм по методу Е.Е. Дубининой (1999). Для анализа уровня ОМБ 0,1 мл гемолизата взаимодействовали с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДФНГ). После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре добавлением 20 % трихлоруксусной кислоты осаждались белки, центрифугировались при 3000 об/мин, удалялся
55
супернатант и трижды промывался осадок смесью (1:1) этанола и этилацетата с целью удаления непрореагировавшего 2,4-ДФНГ и примесей липидов.
Подсушенный осадок растворялся в 2,5 мл 8 М мочевины. Количество образовавшихся 2,4-ДФНГ основного и нейтрального характера регистрировалось при 346, 370, 430, 530 нм. Полученные результаты выражались в мкмоль/мг белка.
Методы определения активности ферментов антиоксидантной системы
Метод изучения активности СОД в биологическом материале базируется на способности этого антиоксидантного энзима конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидный анион. Эти анионы образуются в результате аэробного взаимодействия восстановленной формы НАДН2 с феназин-
метасульфатом. В результате реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразин-тетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ снижается. По расчетному проценту торможения Т%: Т% = (Еф – Еоп) / (Еф – Ек) – определяется процент торможения НСТ (Дубинина Е.Е., 2006).
Определение активности каталазы основан на определении скорости утилизации Н2О2 в реакционной смеси с внесением биологического материала,
содержащего фермент. Интенсивность утилизации Н2О2 определяется по скорости снижения экстинкции при длине волны 260 нм, на которой Н2О2 имеет максимум светопоглощения (Карпищенко А.И., 1999). Результаты выражались в ммоль/мин/л.
Принцип метода, используемого для определения уровня глутатионтрансферазы (ГТ), состоит в определении скорости ферментативного образования GS-2,4-динитробензола в катализируемой ферментом реакции восстановления глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом. Водный раствор образующегося продукта имеет максимум светопоглощения при длине волны 340
нм (Карпищенко, 1999). Полученные результаты выражались в ммоль/мин/л.
Все исследования выполнялись на базе Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета в лаборатории физиологии и биохимии отдела научных исследований (руководитель – д.б.н.,
профессор Т.П. Генинг).
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
56
2.7. Иммуноферментный метод
В сыворотке крови на 3-й и 14-й дни после двух курсов полихимиотерапии иммуноферментным «сэндвич» - методом определялся уровень IL-1β, IL-6, IL-10, IL-18, TNF-α по стандартной методике с использованием наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест-Волга» (г. Н. Новгород).
2.8. Морфологическое исследование
Материал был получен интраоперационно. Операции выполнялись как на начальном, так и на промежуточном этапе на фоне проводимой ХТ.
Объем оперативного вмешательства:
–экстирпация матки с придатками + оментэктомия или биопсия сальника;
–циторедуктивные операции при распространенных процессах.
Полученный материал фиксировался в 10 % забуференном формалине с обычной стандартной проводкой и заливкой в парафин, далее он окрашивался гемотоксилином и эозином с проведением ШИК-реакции.
Биопсийный материал для исследования забирался не позднее 6 часов после проведенной операции. Опухоль измерялась в трех параметрах, оценивался характер роста и локализация, затем вырезались ножом 5-6 кусочков диаметром 6-
7 мм в трех взаимно перпендикулярных плоскостях из центра, промежуточной зоны и краевой части опухоли.
Морфометрический анализ ткани опухоли включал исследование стромы,
паренхимы опухоли, сосудистого русла, зон некрозов, лимфоидноклеточной инфильтрации новообразования.
Патоморфологические исследования были выполнены в патологоанатомической лаборатории Ульяновского областного клинического онкологического диспансера (заведующий патологоанатомической лабораторией – В.В. Занкин).
57
Критерии оценки ответа опухоли на лечение по RECIST
Для оценки проводимого лечения ВОЗ принята общая клиническая классификация степеней оценки опухоли, основанная на изменении линейных размеров новообразования. В настоящее время существует новая версия 1.1
RECIST (2008 г.), которая отличается как граничными значениями количественных показателей, так и увеличением количества оцениваемых параметров.
Ответ в основных очагах определялся следующим образом:
–полный ответ (СR): исчезновение всех основных очагов;
–частичный ответ (PR): уменьшение суммы диаметров основных очагов не менее чем на 30 % в сравнении с исходной суммой диаметров;
–прогрессирование заболевания (PD): увеличение на 20% и более суммы диаметров основных очагов в сравнении с наименьшей суммой диаметров, а также появление одного или нескольких новых очагов;
–стабилизация заболевания (SD): недостаточное уменьшение, чтобы соответствовать критериям PR, или недостаточное увеличение, чтобы соответствовать критериям PD.
Оценка лечебного патоморфоза
Оценка ответа опухоли на поздних стадиях аденокарциномы яичников высокой степени злокачественности производилась по 3-балльной системе CRS (chemotherapy response score), предложенной в 2015 г. S. Böhm и др.: 1 балл – ответ опухоли отсутствует или минимальный; 2 балла – выраженный ответ опухоли; 3
балла – полный или почти полный ответ опухоли. Окраска всех препаратов производилось гематоксилином и эозином, увеличение – в 10-20 раз.
2.9. Оценка качества жизни, безрецидивной выживаемости больных и
токсичности химиотерапии
Качество жизни (КЖ) пациенток оценивалась с использованием анкеты-
опросника Европейской организации исследования и лечения рака (EORTC-QLQ- C30), включающего 30 вопросов. Он широко применяется при раличных
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
58
онкологических заболеваний во многих международных клинических исследованиях. Для пациенток, что самое главное, анкета проста в заполнении, а
для исследователя в обработке результатов. Современная версия EORTC-QLQ-C30
состоит из основных шкал: пять функциональных шкал, включающие физический
(PF), ролевой (RF), познавательный (когнитивный) (CF), эмоциональный (EF) и
социальный (SF) статусы, три симптоматические шкалы, характеризующие утомляемость (FA), боль (PA), тошноту и рвоту (NV), а также шкала общего состояния здоровья и уровня КЖ (QL2). При этом оценивались и дополнительные симптомы: одышка (DY), нарушение сна (SL), снижение аппетита (AP), запор
(CO), а также денежные затруднения (FI), вызванные заболеванием и его лечение.
Для интерпретации результатов опросника все показателя были отражены в линейную шкалу от 0 до 100 единиц и высчитывались по формуле: Sy = (Sx – Smin / Smax – Smin) × 100, где Smaxмаксимальное количество баллов (100), Smin –
минимально количество баллов, Sx – количество баллов полученные по результатам опросника, Sy – количество баллов по шкале.
В результате для функциональных шкал высокий коэффициент соответствует высокому уровню качества жизни, а для симптоматических шкал высокие значения отвечают набольшей выраженности проявления симптома.
Полученные показатели шкал КЖ были статистически обработаны методом
Wilson–Mann–Whitney.
Оценка токсичности химиотерапии
Оценка токсичности лечения проводилась после 2-го курса ХТ по шкале
Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) v5.0. Оценка гематологической токсичности осуществлялась по анализам еженедельного обследования больных, а также перед каждым курсом ХТ. Контроль негематологической токсичности определялась перед введением препаратов. На момент начала ХТ пациентки имели общий статус по ECOG от 0 до 3 и
предполагаемую продолжительность жизни не менее 6 недель. У всех обследуемых были нормальные показатели крови и отсутствовали
59
декомпенсированные хронические заболевания.
Оценка безрецидивной выживаемости
Безрецидивная выживаемость определялась с момента окончания лечения до наступления первого рецидива заболевания. Анализ безрецидивной выживаемости осуществлялся с помощью построения кривых Каплана-Майера и использованием лог-рангового критерия.
2.10. Статистическая обработка результатов
При статистической обработке данных для количественных переменных проводился тест на нормальность распределения при помощи критерия Шапиро – Вилка. Для оценки достоверности различий применялся непараметрический критерий Манна – Уитни (Stava v.6.0). Различия считались статистически значимыми при р≤0,05 от уровня контрольной группы. Таблицы сопряженности анализировались с помощью критерия Пирсона. Анализ корреляций между признаками осуществлялся с помощью метода Пирсона. Расчет выполнялся на персональном компьютере с использованием программы Microsoft Excel и пакета статистического анализа Statistika 8.0 for Windows (StatSoft Inc., USA).
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
60
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Редокс-статус крови и цитокиновый статус больных распространенным раком яичников
В результате проведенных исследований установлена активация процессов ПОЛ в плазме крови (таблица 3.1) и в эритроцитах (таблица 3.2) больных РЯ по сравнению с донорами. При этом в плазме крови у больных РЯ статистически значимо были повышены уровни всех изученных показателей, за исключением ДК, а в эритроцитах – все показатели ПОЛ, кроме КД.
Одновременное повышение активности антиоксидантных ферментов ГТ в плазме крови и ГТ и СОД в эритроцитах может свидетельствовать о переходе системы ПОЛ – АОЗ на более высокий уровень функционирования. Активность каталазы как в плазме крови, так и в эритроцитах может указывать на снижение опухолевыми клетками генерации Н2О2, ингибирующей размножение клеток.
Считается установленным, что усиление редокс-зависимой (окислительной)
модификации белков имеет место при различной патологии. В отличие от продуктов ПОЛ, карбонильные производные белков плазмы и эритроцитов более стабильны и специфичны. Нами выявлено значимое повышение содержания продуктов ОМБ в плазме крови по сравнению с контролем у больных РЯ на распространенной стадии заболевания (таблица 3.1), что может свидетельствовать о состоянии карбонильного стресса. Содержание продуктов ОМБ в эритроцитах колебалось в пределах коридора нормы (таблица 3.2).
Установлено, что опухолевый процесс у онкологических больных влияет на редокс-зависимые процессы в нейтрофилах. Нами было обнаружено значимое повышение абсолютного и относительного количества Нф периферической крови у больных РЯ по сравнению с донорами (таблица 3.3). При этом в Нф больных РЯ повышена активность МПО, а также увеличено количество активных Нф в спонтанном НСТ-тесте (таблица 3.3).