11
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Ульяновский государственный университет» Института медицины, экологии и физической культуры Министерства образования и науки Российской Федерации от 28.03.2022, протокол №8.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практическую деятельность гинекологического отделения ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» г. Ульяновска, а также вучебный процесс на кафедре онкологии и лучевой диагностики медицинского факультета Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ульяновский государственный университет» Института медицины, экологии и физической культуры Министерства образования и науки Российской Федерации.
Личный вклад автора. Автором полностью выполнена клинико-
лабораторная оценка полученных в исследовании результатов. Анализ данных литературы по теме диссертации, статистическая обработка полученных результатов исследования, написание диссертации также выполнены лично автором.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Всоответствии с формулой специальности 3.1.6 – онкология, лучевая терапия (медицинские науки), область диссертационного исследования соответствует пункту 2. Исследования по изучению этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, основанные на достижениях ряда естественных наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии, биохимии и др.).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 17 печатных работ, из которых 8 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РоссийскойФедерации, 2-в рецензируемых изданиях Web of Science и Scopus. Получен1патентнаизобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения
12
результатов, выводов, практических рекомендаций, перспектив дальнейшей разработки темы, списка сокращений. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 27
таблицами. Библиографический указатель включает 11 отечественных и 230
зарубежных источника.
13
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1Эпидемиология рака яичников
Значения эпидемиологических показателей рака яичников неравномерно распределяются по странам и регионам. Наибольшая заболеваемость РЯ наблюдается в странах Центральной и Восточной Европы (стандартизированный по возрасту показатель заболеваемости 10,7 на 100 тыс.), в том числе Польше,
Венгрии, Словакии, Беларуси, а также Российской Федерации, где показатель заболеваемости в 2020 г. достиг 10,2 на 100 тыс. – гораздо выше среднего общемирового [85]. В Ульяновской области заболеваемость в 2019 г. составила
9,02 на 100 тыс.
Заболеваемость РЯ в РФ повысилась на 4,38% с 2009 г. по 2019 г. В 2019 г.
в РФ средний возраст больных при установлении диагноза составил 59 лет [7], в
то же время ожидаемая продолжительность жизни в 2018 г. достигла своего исторического максимума в 76,2 лет [204]. Несмотря на то, что РЯ находится лишь на девятом месте в структуре заболеваемости злокачественными опухолями женского населения России, стандартизированный показатель смертности от данного заболевания крайне высок – 5,3 на 100 тыс. в 2020 г. при среднем общемировом 4,2 на 100 тыс. В Ульяновской области в 2019 г. смертность от РЯ была выше среднего уровня по РФ (4,89 на 100 тыс.), а именно 5,39 на 100 тыс. В
период с 2009 по 2019 гг. смертность от РЯ в России в целом значительно снизилась, однако в последние три года остается на стабильном уровне.
В возрастной группе 50-59 лет РЯ занимает второе место по смертности женщин от ЗНО после РМЖ. Это очень высокая доля смертности, учитывая огромную разницу в числе заболевших РМЖ и РЯ. Также смертность от РЯ высока в группе женщин в возрасте 40-49 лет (третье место в структуре смертности от онкопатологии в данной группе). При этом все попытки разработать скрининговые тесты для рака яичников пока не увенчались успехом:
неинвазивные и малоинвазивные методы, такие, как УЗИ гениталий и
14
определение СА-125, не обладают достаточной специфичностью. Летальность на
первом году с момента установления диагноза РЯ составляет 21,3% [8].
1.2 Циркулирующие опухолевые клетки в прогрессировании рака
яичников
Клетки паренхимы рака яичников и других ЗНО способны покидать опухолевый очаг, в котором они возникли, и поступать в системный кровоток. С
момента проникновения в просвет сосуда такие клетки называют циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК). ЦОК в крови онкологических пациентов обнаружили еще в 1869 году [26], однако большой интерес к ним появился в последнее десятилетие с развитием лабораторных технологий. Хотя количество ЦОК обычно возрастает прямо пропорционально стадии заболевания,
первое появление опухолевых клеток в кровотоке - раннее событие: оно может происходить еще до того, как опухоль определяется гистологически [73].
В кровеносном русле ЦОК находятся в виде единичных клеток или в виде кластеров, состоящих только из ЦОК (гомотипичные кластеры) либо включающих также клетки стромы опухоли и ее межклеточный матрикс
(гетеротипичные кластеры) [107]. Период полужизни опухолевых клеток в крови измеряется минутами или часами, однако новые клетки постоянно отщепляются от ткани и поступают в кровоток [43].
Выделение и анализ ЦОК представляют интерес для клинической практики как методы жидкой биопсии, с соответствующими целями и задачами
(прогностической, предиктивной и др.) [57]. С точки зрения биологии канцерогенеза ЦОК можно назвать наиболее «опасным» компонентом опухоли в периферической крови, поскольку жизнеспособная ЦОК может совершить экстравазацию, а затем дать начало метастатическим и рецидивным очагам в рамках гематогенной диссеминации. Однако это происходит далеко не всегда:
лишь 0,2% ЦОК выживают в непривычных условиях кровотока [22], и, вероятно,
еще меньшая доля клеток успешно располагается в преметастатической нише и начинает пролиферировать.
15
До настоящего момента точно не известно, какие факторы являются определяющими в судьбе ЦОК. Безусловно, периферическая кровь создает множество источников стресса для клетки, больше адаптированной к микроокружению опухолевой ткани: это физические факторы, например,
напряжение сдвига; оксидативный стресс; недостаток факторов роста и цитокинов; аноикис – гибель в отсутствие субстрата для прикрепления [163].
Взаимодействие ЦОК с компонентами крови может как снижать, так и повышать выживаемость первых, изменять их профиль экспрессии генов, способность к выходу из сосуда в ткани и метастазированию [86]. Например, ЦОК и нейтрофилы при помощицитокиновойсигнализации способны объединяться в кластеры (нейтрофилы секретируют TNF-α, IL-1β, IL-6, а ЦОК экспрессируют рецепторы к ним; в то же время ЦОК секретируют G-CSF, TGF-β3 и IL-15,
рецепторы к которым имеются на нейтрофилах). В подобном кластере ЦОК приобретают более агрессивные, туморогенные свойства [149].
Если ЦОК смогла достигнуть органа-мишени и не погибнуть в нем, велик шанс того, что она будет персистировать в дормантном состоянии, не продвигаясь по стадиям клеточного цикла. Продолжительность дормантного состояния определяется комбинацией свойств самой клетки, ее нового микроокружения и состояния иммунологического надзора в нем [122]. Длительно персистирующие в состоянии дормантности клетки могут стать основой развития отдаленного рецидива болезни, если дожидаются наступления благоприятных окружающих условий. В данном случае работает классическая гипотеза «семени и почвы»
(«seedandsoil»), предложенная Стефаном Педжетом в 1889 г.[164], которая гласит,
что развитие метастаза определяется характеристиками как атипичной клетки, так и среды, в которую она попала. Интересно, что ЦОК могут статьисточником и локального рецидива, поскольку "почва" первичного очага часто благоприятна, и
клетки возвращаются обратно (само-обсеменение опухоли)[ 186]. Большое значение в привлечении клеток в тот или иной орган отводится цитокинам:
некоторые секретируемые опухолью цитокины могут функционировать как хемоаттрактанты для ЦОК [41]. Роль цитокинов в частности и микроокружения
16
«почвы» в целом связывает судьбу ЦОК с феноменом опухоль-ассоциированного
воспаления, которое способствует опухолевой прогрессии (рис. 1).
Рисунок 1. - Возможные варианты судьбы циркулирующей опухолевой клетки (ЦОК). После отщепления от опухолевой массы – пассивного вследствие неполноценности межклеточных контактов в опухоли и стенок опухолевых кровеносных сосудов, либо активного вследствие агрессивных свойств самой клетки – жизненный цикл ЦОК может развиваться пятью путями. Наиболее часто ЦОК погибает в кровотоке (1) из-за физических сил потока крови (shearstress), аноикиса, воздействия биологически активных веществ, негативного взаимодействия с клетками крови. Кроме того, попав из кровотока в ткани с нормально функционирующим иммунологическим надзором (2), бывшая ЦОК также погибнет, будучи распознана как источник неоантигенов. Остальные возможные сценарии развиваются при наличии более или менее благоприятной метастатической ниши. При самообсеменении (3) нишей является орган-источник, куда ЦОК возвращается снова и может давать начало отличному от существующих опухолевому клону, если за период циркуляции клетка приобрела новые особенности. Клиническим последствием может быть локальная прогрессия опухоли. При попадании в благоприятную нишу (4), которую могут создавать клеточные и неклеточные компоненты микроокружения ткани (толерантные иммунные клетки; цитокины, запускающие проопухолевыесигналинги; необходимые метаболические условия и др.), бывшая ЦОК пролиферирует и формирует метастатическую опухоль. Клиническим последствием становится ранний рецидив или прогрессирование с формированием нового очага. Если ниша недостаточно благоприятна для пролиферации, но и не элиминирует атипичную клетку, то может наступать состояние дормантности опухолевой клетки (например, за счет обратимой аутофагии) (5). В случае возникновения благоприятных условий клетка приступи к пролиферации. Клиническим последствием последнего сценария может быть отдаленный рецидив заболевания.
17
Исследование ЦОК принципиально может быть как количественным, так и качественным. Прогностическая ценность количественного подсчета ЦОК продемонстрирована для рака молочной железы (РМЖ), немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), колоректального рака (КРР) и других злокачественных опухолей
[171, 172]. В крови пациенток с эпителиальным раком яичников ЦОК были впервые зарегистрированы в 2003г.; в зависимости от метода детекции,
количество ЦОК-позитивных пациенток с РЯ в различных исследованиях варьируется от 18,0 до 88,0% [169, 170]. Число ЦОК также возрастает при распространенных стадиях рака яичников и низкой дифференцировке первичной опухоли [218]. Циркулирующие опухолевые клетки при РЯ были обнаружены даже после выполнения оптимальной циторедуктивной операции, что может служить критерием наличия минимальной остаточной болезни, поскольку общая выживаемость (ОВ) таких пациенток оказалась ниже, чем ЦОК-отрицательных
[156]. Кроме того, повышение количества ЦОК в крови пациенток РЯ после окончания платиносодержащей терапии ассоциировано со снижением выживаемости без прогрессирования (ВБП) [114]. Прогностическая значимость ЦОК при РЯ продемонстрирована в мета-анализах [62, 228].
Значительное препятствие к внедрению в практику кроется в методике проведения тестирования. ЦОК малочисленны в сравнении с форменными элементами крови, и для анализа их свойств на первом этапе необходимо выполнить отбор, или обогащение – в первую очередь, отличить опухолевые клетки от лейкоцитов. Обогащение можно проводить с помощью целого ряда методов, и если в целом большинство авторов сходятся во мнении о наличии ассоциаций между ЦОК и клиническим течением ЗНО, то при рассмотрении каждой уникальной работы можно наблюдать совершенно разную методологию,
начиная от отбора по размеру клеток в специально созданных устройствах и заканчивая флюоресцентной микроскопией с применением определенных антител. В исследованиях с количественным подсчетом ЦОК уточнения требуют пороговые уровни результата теста: уровень, ниже которого выявление клеток может быть ложноположительным, и уровень, ниже которого детекция не несет
18
прогностического значения. Возможно, для большей точности тестирование следует проводить неоднократно либо в большем объеме крови (стандартный образец для большинства методик выявления – 7,5 мл). В эксперименте invivoна мышах, которым прививали ксенографтные опухоли, авторы наблюдали вариации определяемого числа ЦОК в течение суток. Важно, что у мышей с малым числом ЦОК результаты теста периодически были негативными [194]. Вероятно, с
накоплением научных данных стандартизация анализа ЦОК станет достижимой целью, но существует и более фундаментальная проблема, которая заключается в большом разнообразии фенотипов ЦОК, их гетерогенности.
M. Pearl, Q. Zhao, J. Yang и др. (2014) продемонстрировали, что появление ЦОК с инвазивными свойствами в крови больных РЯ может служить маркером рецидива заболевания, более чувствительным, чем уровень сывороточного СА-
125. Инвазивность клеток авторы определяли как способность поглощать адгезивный матрикс, а опухолевую природу подтверждали на основании экспрессии соответствующих поверхностных маркеров [170]. Активное внедрение в межклеточный матрикс может давать преимущество не только на этапе выхода ЦОК из циркуляции в ткань органа-мишени, но и в начале пути клетки, когда она направляется из опухоли-источника в сторону кровеносного сосуда. В норме эпителиальные клетки яичника не способны ни к активному движению, ни к выработке ферментов, разрушающих матрикс. Такие клетки могут попасть в кровоток пассивно, отсоединившись от соседних из-за аномально слабых межклеточных контактов и избыточно проницаемых сосудов в злокачественном новообразовании. Однако в ходе развития опухоли клетки ее паренхимы часто изменяют свой фенотип, вступая в эпителиально-
мезенхимальный переход (ЭМП), а также обратный ему процесс - мезенхимально-
эпителиальный переход (МЭП).
19
1.3Изменение свойств опухолевой клетки в процессе эпителиально-
мезенхимального перехода и его клиническое значение
Эпителиально-мезенхимальный переход приводит к тому, что эпителиальная клетка приобретает свойства мезенхимальной: ее форма становится веретенообразной, полярность по отношению к базальной мембране ткани утрачивается, возникает способность к выработке матриксных металлопротеиназ (ферментов, переваривающих межклеточный матрикс),
возрастает экспрессия определенных факторов транскрипции. Клетка,
совершившая ЭМП, становится способной к миграции и инвазии, так как теряет межклеточные контакты и приобретает способность к амебоидному движению за счет изменений в структуреактинового цитоскелета [233]. Меняется и состав маркеров на поверхности клетки, в частности, происходит «кадгериновое переключение». Целостность эпителиальной ткани поддерживается при помощи поверхностного белка Е-кадгерина, обеспечивающего межклеточные контакты.
Другой белок адгезии, N-кадгерин, обычно преобладает в неэпителиальных тканях, однако в ходе ЭМП экспрессия Е-кадгерина снижается, а N-кадгерина – повышается. Важно, что контакты на основе различных типов кадгерина запускают внутри клетки разные сигнальные пути и могут модифицировать ее пролиферативную активность [222]. Изменения фенотипа в ходе ЭМП также включают в себя повышение экспрессии виментина, фибронектина и снижение экспрессии белков плотных межклеточных контактов (цитокератинов и окклюдинов), а также ядерную локализацию бета-катенина, Smad-2/3, NF-kappaB, Snai1/2, Twist [121].
Роль ЭМП для организма часто позитивна, ведь он сопровождает не только опухолевую прогрессию, но и иные физиологические и патологические процессы.
Различают несколько типов ЭМП [120]. Переход I типа (классический,
эмбриональный) происходит во время внутриутробного развития плода и обеспечивает разнообразие клеточных типов – к примеру, с его помощью мигрируют клетки нервного гребня. Переход II типа (ЭМП фиброза, регенерации
20
и заживления) может быть индуцирован повреждающими факторами и требуется для восстановления структуры поврежденной эпителиальной ткани. В данном случае клетка обычно совершает МЭП и снова становится эпителиальной, когда реконструкция ткани завершена. Триггерами, запускающими переход II типа,
могут быть медиаторы воспаления, которые секретируют окружающие фибробласты и иммунные клетки, а также белки разрушенного внеклеточного матрикса. Переход III типа (ЭМП канцерогенеза) возникает при онкологическом процессе [103]. Начало перехода этого типа зависит от состава микроокружения клетки. Классическим примером триггера ЭМП из микроокружения считается
TGF-β, но процесс могут запускать множество цитокинов, ростовых факторов,
гипоксия.
Упрощенно представить один из механизмов запуска ЭМП можно следующим образом: связывание лиганда и его рецептора на поверхности опухолевой клетки активирует рецепторные тирозинкиназы (РТК); РТК запускают внутриклеточные каскады реакций, повышая экспрессию факторов транскрипции [94] Smad, NF-κB, STAT3, Twist; факторы транскрипции изменяют экспрессию генов, что приводит к смене фенотипических свойств. Свойственные РТК-зависимым сигнальным путям множественные взаимодействия друг с другом усложняют регуляцию процесса. Кроме того, в ЭМП участвуют и не-РТК-
сигнальные пути, в том числе Notch, Hedgehog и ключевой для РЯ путь Wnt/β- catenin [214], а источником молекул-триггеров могут быть клетки самой разнообразной природы - РЯ-ассоциированные фибробласты [216], нейтрофилы
[148], макрофаги [238] и др. Такая сложная регуляция ЭМП канцерогенеза с огромным количеством взаимодействий способствует максимальной адаптации опухолевой клетки к имеющейся микросреде. Клетка входит в ЭМП в тот момент,
когда этому благоприятствуют окружающие условия, а впоследствии может вернуться в исходное состояние путем МЭП. Это создает новые возможности для прогрессии опухоли и новые трудности для лечения.
Более того, кроме двух конечных Э/М-состояний, существует ряд промежуточных (гибридных) фенотипов. В таком случае клетка останавливается