101
результаты ПЦР и ИФ не согласовывались между собой. Присутствие ЦОК после лечения, но не исходно, в данном исследовании было связано с повышением смертности. Эти наблюдения также предполагают одновременное сосуществование разных подтипов ЦОК и изменение соотношения подтипов в процессе терапии, что может быть особенно актуально для стволовых клеток с их высокой фенотипической пластичностью.
Согласно Loreth D., Schuette M., Zinke J. и др. (2021), изучавшими экспрессию CD44 у пациентов с метастатическими злокачественными опухолями,
этот маркерприсутствует на поверхности большинства ЦОК, но значительно меньшеэкспрессируется в ткани метастатических очагов. Авторы пришли к выводу, что появление CD44 на поверхности ЦОК играет важную роль в движении жизнеспособных клеток по кровеносному руслу. Однако наличие
CD44+ ЦОК было связано с более низкой общей выживаемостью только у пациентов с меланомой, но не с другими опухолями в когорте (рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого).
Результаты, указывающие на различие в соотношениях фенотипов до и во время лечения, были получены и в анализе экспрессии маркеров в ЦОК.
Анализируя выделение ЦОК из крови по двум комбинациям маркеров
(эпителиальные EpCAM, CK-18, E-кадгерин и «более» мезенхимальныеEpCAM,
CK-18, виментин), нами было сделано предположение, что экспрессия маркеров – в большей степени индуктора ЭМП TGFβ – в субпопуляциях будет отличаться,
однако содержание VEGFA, TGFβ, CXCL2 и ERCC1 в эпителиальных и мезенхимальных клетках было одинаковым. Не исключено, что все или большая часть полученных клеток находились в промежуточном фенотипе и экспрессировали Е-кадгерин и виментин одновременно.
В исследовании MehdiS., MacdonaldE., GalpinK.и др. (2020) авторы оценивали туморогенный и метастатический потенциал клеток РЯ и обнаружили,
что эпителиальные клетки ведут себя наиболее агрессивно. Однако при углубленном анализе эпителиальная популяция оказалась ЭМ-гибридной,
экспрессирующейвиментин наряду с эпителиальными маркерами [140]. Все
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
102
больше данных указывает на то, что ЦОК рака яичников имеют ряд промежуточных ЭМ-состояний [90, 123]. Abreu M., Cabezas-Sainz P., AlonsoAlconada L.и др. (2020) также наблюдали гетерогенность фенотипа EpCAM-
позитивных ЦОК при РЯ: клетки экспрессировали как эпителиальные маркеры
MUC1 и CK19, так и «более» мезенхимальные маркеры TIMP1 и CXCR4. Такая фенотипическая гетерогенность экспрессирующих EpCAM ЦОК рака яичников может отражать различия в их метастатическом потенциале.
При факторном анализе полученных нами при исследовании экспрессии маркеров в ЦОК переменных четко выделялись два компонента, условно названные нами Go и Grow. Эти названия были выбраны исходя из одноименной теории о различиях в жизнедеятельности клеток в зависимости от их фенотипа в процессе эпителиально-мезенхимального перехода: эпителиальные клетки больше пролиферируют и не двигаются (Grow), а мезенхимальные клетки способны к миграции и инвазии, но не пролиферируют (Go).Такая тенденция наблюдалась и при РЯ, в клетках сфероидных колоний [182]: сфероиды с высокой экспрессией эпителиального Е-кадгерина имели более прочные межклеточные контакты и были более устойчивы к химиотерапии, тогда как колонии с высокой экспрессией мезенхимального N-кадгерина легче прикреплялись к мезотелию брюшины.
До лечения Go состоял изVEGFA, TGFβ, CXCL2, а Grow – из ERCC1 и VEGFA, а во время ХТ Go включал только TGFβ и CXCL2, а Grow – ERCC1 и VEGFA. Прямые взаимодействия между этими маркерами в процессах внутриклеточной сигнализации не описаны в литературе (согласно базе данных
Reactome [230]). Однако функционально объединение данных показателей в компоненте представляется обоснованным. Так, блокада одного из ключевых факторов ЭМП, Snail снижает экспрессию CXCL2 в клетках РЯ [200]; напротив,
повышение уровня CXCL2 сочетается с повышенной способностью клеток к инвазии (Go) и секреции матриксных металлопротеиназ-2 и -9, что характерно для клеток, подвергшихся ЭМП. Кроме того, CXCL2, секретируемый клетками злокачественных опухолей, привлекает к ним нейтрофилы [236]; при РЯ нейтрофилы экспрессируют CXCR2, который является рецептором CXCL2 [189].
103
Взаимодействие с нейтрофилами может усиливать метастатический потенциал ЦОК и скорость их экстравазации [183]. Повышенная экспрессия TGFβ связана с инициацией ЭМП. В ответ на неблагоприятные условия микроокружения ЦОК с помощью ЭМП может приобретает способность к экстравазации и легче переходит в состояние покоя, становясь менее восприимчивой к цитотоксическому действию химиотерапии [215]. Кроме того, TGFβ позволяет клеткам РЯ избежать иммунного ответа за счет снижения экспрессии главного комплекса гистосовместимости-I на их поверхности [116].
Участие ERCC1 в репарации ДНК доказывает его большое значение в клеточном делении (Grow). Функции VEGFA не ограничиваются ангиогенезом:
при РЯ VEGFA стимулирует самообновление (Grow) опухолевых стволовых клеток [239], а также опосредует экстравазацию (Go) ЦОК [63]. В исследовании invitro [184] в условиях 3D легкий стресс приводил к снижению секреции VEGFA
раковыми клетками, а более сильный стресс той же природы (недостаток питательных веществ и гипоксия) повышал их секрецию VEGFA, что демонстрирует неоднозначность роли данного фактора роста в канцерогенезе. В
нашей когорте экспрессия VEGF в ЦОК существенно не менялась во время химиотерапии по сравнению с уровнем до лечения. Вероятно, ХТ при РЯ напрямую не определяет степень клеточного стресса для ЦОК.
Во время лечения экспрессия маркера платинорезистентностиERCC1 в
эпителиальных ЦОК была выше у пациенток в группе НАХТ (то есть получавших только химиотерапию на момент анализа) по сравнению с АХТ
(прооперированных) (p=0,004). При сравнении с исходным уровнем этот показатель не изменялся при НАХТ и имел тенденцию к снижению при АХТ
(р=0,064). Очевидно, что во время операции были удалены в том числе клетки резистентного клона, но также можно предположить, что операция способствовала активации иммунного ответа с уничтожением агрессивных клеток. Однако в мезенхимальных ЦОК повышение экспрессии ERCC1 при НАХТ и вклад экспрессии ERCC1 в структуру компонента Growбыли
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
104
незначимыми. Мезенхимальные ЦОК способны использовать другие механизмы резистентности.
Количество эпителиальных (CK+vim-) клеток до лечения было выше у пациенток с асцитом на момент постановки диагноза, чем у пациенток без асцита
(p=0,009). Количество мезенхимальных клеток EpCAM-vim+ на фоне лечения было ниже (р=0,018) у пациенток с асцитом, чем без него. Число стволово-
подобных CD44+-клеток в асцитической жидкости коррелировало с числом
EpCAM-vim+ и бифенотипичныхCK+виментин+ в крови весьма высоко (r=0,917, p<0,001 и r=0,861, p<0,001 соответственно), но не коррелировало с количеством эпителиальных СК+виментин- в крови (r=-0,211, p=0,204). В то же время присутствовал ряд отрицательных корреляций между числом различных стволово-подобных клеток в асците и крови. Данные наблюдения можно объяснить миграцией мезенхимальных, стволово-подобных ЦОК из крови в брюшную полость.
Регулятором процессамиграции или распределения ЦОК может служить
VEGF, известный своей ролью в экстравазации ЦОК. Содержание VEGF в асците пациенток с РЯ было намного выше, чем в группе сравнения. Между содержанием VEGF в асците и кровиприсутствовала отрицательная корреляция
(r=-0,852, p<0,001), а повышение уровня VEGFв крови было связано с большим числом CD44-CD133+-клеток в асците (p=0,030). Однако в корреляционном анализе наблюдались подобные взаимоотношения и с другими цитокинами.
Содержание IL-4 в асците отрицательно коррелировало с числом CD44+ в асците
(r=-0,575, p<0,001), но положительно – с числом CD44+ в крови (r=0,582, p<0,001). Таким образом, IL-4 и VEGF могут быть связаны с перемещением ЦОК различных фенотипов: IL-4 – с CD44+, а VEGF – с CD44-. Количество клеток
CD44+CD133+ в крови коррелировало положительно (r=0,709, p<0,001), а
количество CD133+ в асците – отрицательно (r=-0,416, p=0,009) с уровнем IL-18 в
асците. Высокое содержание IL-1β в асците было связано с большим числом
ALDHhigh и CK+vimentin+ в крови (r=0,843, p<0,001 и r=0,868, p<0,001
соответственно). Также в асците наблюдалась отрицательная связь между
105
содержанием CD133+ и IL-10 (r=-0,718, p<0,001). Отрицательные корреляции между уровнями IL-4 и VEGF в асците (r=-0,576, p<0,001), VEGF и IL-18 в асците
(r=0,484, p=0,002) могут быть проявлениями сложной регуляции распределения опухолевых клеток в жидких средах. Например, высокое содержание VEGFи IL-
18 в асците в сочетании с низким уровнем VEGF в крови связано с перемещением
CD133+-клеток в кровь, одновременно с этим низкий IL-4 в асците способствует накоплению в асците CD44+ (рис. 22).
Рисунок 22. – Предполагаемые факторы перераспределения опухолевых клеток между асцитом и кровью на основании корреляционного анализа
В то время как высокий уровень IL-18 в асците коррелировал с высоким числом стволово-подобных ЦОК в крови, высокое содержание IL-18 в крови было ассоциировано с неблагоприятным клиническим течением заболевания. До лечения уровни IL-18 в крови были ниже у тех пациенток, кому впоследствии была выполнена циторедуктивная операция (до или после проведения ХТ) (р=0,016). Содержание IL-18 в крови до лечения было выше у платинорефрактерных пациенток, чем у остальных пациенток в подгруппе, чей рецидив развился позже или не наступил в ходе наблюдения (р<0,001). При разделении пациенток на два кластера ВБП и ОВ (р=0,012 и р=0,030
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
106
соответственно) были ниже в кластере пациенток с высоким уровнем IL-18 и
числом лейкоцитов в крови до лечения. Высокий уровень IL-18 до ХТ служил предиктором меньшей ВБП и ОВ в однофакторном анализе, но в многофакторном анализе терял свою ценность, что согласуется с данными литературы [108].
Возможно, что IL-18 служит индикатором выраженности опухоль-
ассоциированного воспаления, но непосредственно обеспечивают прогрессию другие факторы.
В отличие от IL-18, уровень MALAT1 до ХТ был выше у тех пациенток,
которым впоследствии была выполнена циторедуктивная операция, чем у неоперированных (р=0,007). Между показателями MALAT1 и HOTAIR во время ХТ наблюдалась регрессионная взаимосвязь (R2=0,521, p=0,00001), и оба показателя были выше у пациенток, получавших АХТ, чем НАХТ (p=0,009 и p=0,016 соответственно). Более того, уровень MALAT1 у химиочувствительных пациенток был выше как до (р=0,0001), так и во время ХТ (р=0,0004), и при более высокой экспрессии до лечения ВБП и ОВ демонстрировали тенденцию к повышению (ОР 0,84, 95% ДИ, 0,69-1,02, p=0,077). Очевидно, что здесь выполнение хирургического вмешательства играло роль вмешивающегося фактора, но распределение по стадиям и наличию асцита в подгруппах с высоким и низким содержанием MALAT1 было практически одинаковым, а подгруппа высокой экспрессии включала несколько больше пациенток, получавших НАХТ
(то есть неоперабельных на первом этапе лечения). Таким образом, результат может быть связан как с дефектом процесса набора пациенток (малым размером выборки), так и с действительным различием в экспрессии MALAT1 в
зависимости от неучтенных факторов: например, распространенности процесса внутри брюшной полости, которую невозможно оценить по RECIST, либо гистологических или молекулярных характеристик заболевания, либо особенностей иммунного ответа.
Интересно, что высокое содержание MALAT1 до ХТ, парадоксальным образом связанное с более благоприятным течением заболевания, было ассоциировано с низкой экспрессией ERCC1 в виментин+ ЦОК (r=-0,578, p=0,009)
107
и высокой экспрессией CXCL2 в кадгерин+ ЦОК во время ХТ (r=0,519, р=0,022).
Высокая экспрессия ERCC1 и низкая экспрессия CXCL2 ЦОКами были в целом связаны со снижением ВБП пациенток, хотя в многофакторном анализе значимость присутствовала только для ERCC1 в кадгерин-позитивной и CXCL2 в
виментин-позитивной популяциях – показатели, не имевшие корреляций с уровнями MALAT1.
Результаты факторного анализа с учетом паттерна экспрессии маркеров в ЦОК согласуются с результатами анализа выживаемости: для ERCC1 и VEGF,
объединившихся в фактор Grow, более высокая экспрессия ассоциировалась с низкой ВБП, а для CXCL2 и TGFb, составлявших Go, – с длительной ВБП. Кроме того, низкий уровень «мезенхимального» TGFβ в «мезенхимальной» же фракции виментин+ на фоне химиотерапии был связан с более распространенной стадией болезни (p=0,003). Данные литературы также подтверждают роль ERCC1+ ЦОК при РЯ как неблагоприятного предиктора для ВБП – как до [80], так и после проведения химиотерапии [79]. Экспрессия остальных оцененных нами в данном анализе показателей (VEGF, CXCL2 и TGFb) в ЦОК рака яичников до настоящего времени не изучалась.
Наши данные подтверждают опасность стволовых ЦОК с точки зрения рецидива болезни – меньшее количество стволово-подобных
CD133+ALDHveryhigh-клеток (ОР 1,06 95% ДИ 1,02-1,12, р=0,010) связано с большей ВБП. Клетки РЯ, экспрессирующие на поверхности CD133 и ALDH,
способны взаимодействовать с тромбоцитами, в результате чего снижается эффективность стандартных цитостатических препаратов [111]. Как отмечено выше, число CD133+ALDHveryhigh до лечения коррелировало с числом мезенхимальных клеток, но во время лечения корреляция исчезала. В то же время неблагоприятная прогностическая роль высокой экспрессии ERCC1 и низкой экспрессии CXCL2 в ЦОК статистически значимо проявлялась в образцах во время, но не до лечения. Косвенно это может отражать смену фенотипа стволовых клеток в ходе химиотерапии на более эпителиальный с приобретением большей агрессивности. В литературе описаны свидетельства того, что для стволовых
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
108
клеток РЯ не характерен чисто мезенхимальный фенотип; скорее, этот пул опухолевых клеток пластичен, бифенотипичен и близок к эпителиальному.
Учитывая вышеизложенное, вопрос о конкретном соотношении между экспрессией указанных маркеров и стволовостью ЦОК с учетом ЭМ-фенотипа является перспективным направлением для дальнейших исследований. Данная работа описывает ряд наблюдений, указывающих на роль циркулирующих опухолевых клеток и их фенотипической пластичности в клиническом течении заболевания, а также на соотношения цитокинового и клеточного состава крови и асцита пациенток. Возможно, что именно в этой научной области располагаются биологические основы трудностей в терапии рака яичников.
109
Заключение
В рамках данной диссертационной работы выполнен анализ зарубежных,
отечественных и собственных исследований в области перспектив применения жидкой биопсии при раке яичников, в частности, количественного и качественного анализа циркулирующих опухолевых клеток, экспрессии циркулирующих в периферической крови lncRNA, содержания цитокинов в крови и асцитической жидкости, подсчета стволово-подобных опухолевых клеток в асците.
Литературные данные в указанной области в основном представлены фундаментальными работами, а также исследованиями по количественной оценке ЦОК эпителиального фенотипа, продемонстрировавшими противоречивые результаты; кроме того, в литературе описано неблагоприятное прогностическое значение экспрессии маркера платинорезистентностиERCC1 в ЦОК, что подтверждается и нашими результатами. В дополнение к этому мы показали позитивное прогностическое значение экспрессии в ЦОК CXCL2, связанного с более мезенхимальным фенотипом клеток. Мы также предположили о присутствии большого числа бифенотипичных клеток в крови пациенток на основании схожих уровней экспрессии изученных маркеров в популяциях клеток,
выделенных с помощью антител к эпителиальным и мезенхимальным маркерам.
Группа отечественных исследователей из Томского НИМЦ уже описывала высокую гетерогенность опухолевых клеток в асците пациенток с РЯ и корреляции числа некоторых из фенотипов с распространенностью канцероматозабрюшины. Мы также наблюдали присутствие различных фенотипов опухолевых клеток в асците и установили ряд корреляций с цитокиновым профилем асцита и крови, которые могут отражать механизмы распределения опухолевых клеток между жидкими средами организма.
Высокая пластичность стволовых опухолевых клеток, описанная в литературе, отражена и в полученных нами результатах в той степени, насколько это может быть оценено в работе с пациентками, без использования invitro и
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
110
invivo моделей. Результаты корреляционного, факторного, кластерного анализов с учетом показателей, полученных до лечения, и тех же показателей из образцов во время лечения отличались. Используя маркеры клеточной поверхности,
указывающие на стволовость клеток РЯ по данным литературы, мы продемонстрировали негативное прогностическое значение одного из фенотипов стволово-подобных ЦОК – CD133+ALDHveryhigh, но не нашли значимого вклада стволового маркера CD44. При этом негативная роль CD44 в ткани первичного очага РЯ неоднократно подтверждалась исследователями, но значение экспрессии
CD44 на ЦОК при других злокачественных опухолях вариабельно, а работ по оценке CD44 на ЦОК рака яичников в доступной литературе мы не обнаружили.
Таким образом, мы могли наблюдать не только гетерогенность подтипов ЦОК, но
игетерогенность функционального значения маркеров опухолевых клеток в ткани
икрови, а также «гетерогенность» значимости клеточных подтипов в клиническом течении болезни.
Учитывая неблагоприятный прогноз рака яичников и недостаточное понимание биологии процессов рецидивирования и химиорезистентности этого заболевания, наши результаты обосновывают целесообразность проведения последующих исследований. Целью этих исследований может стать подробное описание фенотипа опухолевых клеток в крови и асцитической жидкости пациенток и выявление маркеров, экспрессия которых связана со смещением фенотипа в эпителиальном либо мезенхимальном направлении. Учитывая продемонстрированные нами связи с клиническими характеристиками процесса,
открытия в указанной области могут принести значительную пользу в лечении РЯ, став основой для стратификации пациенток, а также, возможно, разработки новых препаратов и новых методов диагностики и наблюдения.
На основании полученных результатов предлагается алгоритм дополнительных лабораторных исследований, необходимых для прогноза течения распространенного эпителиального рака яичников (рис.23).