2 курс / Нормальная физиология / Основы_физиологии_гемостаза_Струкова_С_М_

все углеводы фактора X , содержит на N-конце гликозилированный пептид активации ( 52ао) и каталитический (протеазный) домен.

ТФ/VIIa образуя тройной комплекс с фактором X (ТФ/VIIa/X) расщепляет его со скоростью в 2х107 раз большей, чем свободный фактор VIIa . Комплекс ТФ/VIIa отщепляет N- концевой пептид активации , гидролизуя одну связь

Arg194-Ile195 в тяжелой цепи , что приводит к образованию каталитически активного фактора Xа ( триада активного центра - His236,Asp282 и Ser379) .

Молекула фактора Xа остается ассоциированной с комплексом через N-

концевой Гла –домен легкой цепи .

Моделирование структуры комплекса TФ/VIIa/Xa с помощью докинга

(анализа комплементарности третичных структур) и сайт-направленного мутагенеза, показало, что фактор Xа имеет протяженную конформацию,

подобную структуре фактора VIIa в комплексе TФ/VIIa . Во взаимодействии с

TФ/VIIa участвуют все домены фактора Xа, в том числе аминокислотные остатки Glu51 и Asn57 первого домена EGF, Asp92 и Asp95 второго EGF домена и Asp185a, Lys186, и Lys134 каталитического домена фактора Xа.

N-конец каталитического домена ориентирован таким образом, что может осуществляться как активация фактором Xа фактора VII, связанного с тканевым фактором, так и активация фактором VIIa профермента - фактора X .

Следует подчеркнуть, что комплекс ТФ/VIIa имеет чрезвычайно узкую субстратную специфичность, активируя ограниченным протеолизом только факторы X и IX.

Вначале образуется небольшое количество (пкМ) фактора Xa, который не только активирует фактор VII, связанный с тканевым фактором, но также

стимулирует появление следовых (нМ) концентраций тромбина, достаточных

для активации кофакторов - факторов V и VIII - в активные формы (факторы Va

свертывания (рис. 2-20,2-22).

81

Тромбин, который генерируется из протромбина под действием протромбиназы, усиливает свое собственное образование по механизму положительной обратной связи. Тромбин активирует фактор XI контактной фазы в протеиназу – фактор XIа, в свою очередь активирующий фактор IX .

Врожденная недостаточность фактора IX и его кофактора VIII фактора (

вследствие дефектов структуры их генов) ассоциируется с гемофилиями В и А

соответственно. Если бы гемостаз осуществлялся через прямую активацию фактора X комплексом тканевой фактор – факторVIIa, то участие фактора IX не было бы столь необходимым и его недостаточность не приводила бы к гемофилии. Гемофилия А, наследуемая по сцепленному с X-хромосомой типу,

встречается с частотой 1,3-1,8 на 10000 мужчин, а гемофилия В ( ген фактора IX

также локализован в X-хромосоме) – в 4 раза реже. Описано более 600 разных мутаций в генах факторов VIII и IX. Оба типа гемофилийзаболевания ,

связанные с полом. Если мужчина – гемофилик (с одной аномальной X-

хромосомой) и здоровая женщина (с двумя нормальными X-хромосомами)

имеют детей, то все дочери будут носителями дефектной хромосомы, а сыновья будут здоровыми. Женщины -носители гена гемофилии не имеют тенденции к кровоточивости, поскольку наследуют нормальный аллельный ген от матери,

обеспечивающий 50% активности FVIII от нормы. Но если женщина –

носитель гена гемофилии имеет детей от здорового мужчины, ее сыновья имеют

шанс унаследовать гемофилию в 50% случаев, а дочери, так же в 50% случаев,

могут быть носителями гемофилии. Около 1/3 больных гемофилией не имеют

семейного происхождения заболевания. Эти спорадические случаи возникают вследствие новых мутаций в Х- хромосоме, несущей гены факторов VIII и IX.

ингибиторов Кунитца и состоит из тандема трех доменов Кунитца (К1, К2 и К3),

из которых первый (К1) ингибирует фактор VIIa, связанный с тканевым фактором, а второй (К2) – фактор Xa. Третий домен не имеет ингибиторной активности к протеазам, но в его структуре (прежде всего в положительно заряженной С–концевой последовательности молекулы TFPI) локализован

85

участок связывания протеогликанов эндотелия, таких как синдеканы и глипиканы . TFPI специфично связывается с тромбоспондином-1 тромбоцитов.

Этот ингибитор обнаружен в плазме в относительно низкой концентрации, а

также в эндотелии сосудов и тромбоцитах. Когда тканевой фактор появляется на поверхности активированных клеток, TFPI ингибирует инициирование каскада свертывания следующим механизмом. Сначала TFPI с высоким сродством связывает фактор Xa и образует с ним комплекс (через второй домен), затем связывается (через С-конец третьего домена) с отрицательно заряженными протеогликанами мембраны клеток. Повышается локальная концентрация

ингибитора. Затем TFPI связывает фактор VIIa и инактивирует комплекс

TФ/VIIa. Таким механизмом контролируется и ограничивается образование

фактора Xa. Поэтому для появления эффективных концентраций фактора Xa в

условиях in vivo ( достаточных для генерации относительно высоких концентраций тромбина и свертывания фибриногена) необходима генерация наряду с комплексом фактор VIIа - тканевой фактор также комплекса фактора

IXa с фактором VIIIa .

TFPI блокирует способность TФ/VIIa активировать фактор X и клетки через рецепторы, активируемые протеиназами.

Тройной комплекс ТФ/VIIa/X активирует PAR 1 и 2 на клетках. Присоединение фактор Xа к комплексу TФ/VIIa повышает в 5 раз интенсивность клеточного ответа по сравнению с действием одного фактора Xа. Тканевой фактор активирует клетки протеолитическим механизмом, зависимым от фактора VIIa

свертывания крови, в котором тканевый фактор работает как кофактор и модулятор фактора VIIa . Связывание фактора VIIа с тканевым фактором стимулирует передачу запуск внутриклеточной сигнализации, приводя к повышению внутриклеточного Ca2+ , фосфорилированию активируемых митогеном протеинкиназ, транскрипционных факторов и, в конечном счете, к

синтезу и экспонированию адгезивных белков , ответственных за адгезию и миграцию клеток.

Итак, процесс свертывания распространяется и поддерживается активацией фактора IX. Факторы IXa и Xa проявляют свою активность при ассоциации с неферментативными кофакторами-факторами VIIIa и Va , соответственно

(Таблица 4). Факторы V и VIII -большие гликопротеиды, которые

86

активируются протеолизом определенных связей фактором Xa или тромбином.

Активные кофакторы - Va и VIIIa, состоят из субединиц, стабилизированных Са2+ , и связываются с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран,

протеиназамифакторами Xa и IXa, и субстратами этих ферментов – протромбином и фактором X.

2.3.2.4. Особенности активации протромбина.

Активация протромбина в тромбин – ключевая реакция системы свертывания крови, имеет как ряд сходных черт, так и особенностей,

отличающих этот процесс от активации проферментов других сериновых протеиназ.

Протромбиназный комплекс (факторы Ха, Va, Са2+ и фосфолипиды мембран) превращает протромбин в тромбин. В стехиометрическом комплексе фермента - фактора Xa и кофактораVa происходят конформационные изменения в активном центре фермента, облегчая взаимодействие фактора Xа с субстратом-протромбином. Подобные изменения происходят в тенназном комплексе (факторы IХа,VIIIa,Са2+и фосфолипиды мембран), обеспечивая эффективную активацию фактором IХа субстратафактора Xa).

Протромбин, связываясь с фактором Va и Xa, также претерпевает изменения, обеспечивающие эффективное взаимодействие между ферментом-

фактором Xa и субстратом. Скорость реакции возрастает более чем на 5

порядков. Это увеличение происходит как за счет повышения сродства фермента к субстрату (снижения каталитической константыKm) , так и за счет повышения скорости реакции (возрастания каталитической константы-kcat).

Отличительная особенность превращения протромбина в тромбин - это необходимость отщепления половины молекулы протромбина в процессе формирования тромбина, тогда как активация других факторов свертывания ведет к освобождению только активационных пептидов.

других факторов протромбинового комплекса, которые после превращения в

фермент остаются связанными с поверхностью мембраны клетки через Гла-

домен, тромбин не имеет в структуре этого домена и освобождается после

87

активации. В структуре тромбина формируется новый центр связывания с рецепторами мембраны клетки.

В протромбине выделяют три домена: N-концевой фрагмент 1, фрагмент

2 и каталитический доменпретромбина 2, предшественник тромбина ( рис. 2-24

).

88

РИС 2-24

Схема превращения протромбина в тромбин.

Фактор Xa превращает протромбин в тромбин, расщепляя связь по Arg320 в

претромбине 2 и образуя мейзотромбин, в котором гидролизует связь по

Arg271 и освобождает тромбин.

комплекса осуществляет ограниченный протеолиз протромбина в несколько стадий ( рис. 2-24 ).

На первой стадии фактор Xa протромбиназного комплекса расщепляет одну

пептидную связь Arg320-Ile321 в структуре каталитического домена

протромбина - претромбине 2. Образуется первый промежуточный продукт-

мейзотромбин, в котором две вновь образованные цепи молекулы протромбина

прокоагулянтную активность тромбина и не инактивируется антитромбином III.

Вместе с тем мейзотромбин проявляет вазоконстрикторную активность.

На следующей стадии фактор Xa в гидролизует еще одну связь ( Arg271Tre272) в структуре мейзотромбина между фрагментом 2 и претромбином 2,

отщепляя большой фрагмент 1 + 2 и освобождая тромбин.

Тромбин состоит из двух цепей ( А-легкой и В –тяжелой) соединенных дисульфидной связью. В структуре тяжелой цепи локализован каталитический центр и участки связывания субстратов.

В структуре протромбина тромбин может специфически расщеплять связь

Arg155 – Ser 156, освобождая фрагмент 1 протромбина и приводя к образованию претромбина 1. Однако эта реакция требует достаточно высоких концентраций фермента, которые не возникают при физиологической активации протромбина в условиях in vivo, но возможно появляются при патологии свертывания крови.

90