2 курс / Нормальная физиология / Основы_физиологии_гемостаза_Струкова_С_М_
.pdf
Тромбинпервый фермент в каскаде свертывания, который освобождается в окружающую среду. В структурах всех других ферментов - активных форм факторов свертывания крови, после активации сохраняются участки связывания профермента с поверхностью клетки.
2.4. Функции протеиназ системы свертывания крови
2.4.1. Тромбин: структурно-функциональные особенности.
Тромбин-протеолитический фермент, относится, как и все ферменты свертывающей системы крови (кроме фактора XIIIa), к группе пептид-гидролаз,
подгруппе протеиназ, классу сериновых протеиназ семейства трипсина.
Тромбин – гликопротеид( 37 kDa), содержащий около 5% углеводов. Молекула тромбина состоит из двух полипептидных цепей ( А и Б), соединенных дисульфидной связью (рис. 2- 25).
91
РИС.2-25
Структура молекулы тромбина.
Тромбин cвязан в активном центре с ингибитором |
PPACK (D-Phe-Pro-Arg- |
||
хлорметилкетоном ) и ионом Na. |
|
|
|
Молекула тромбина состоит из двух полипептидных цепей |
(А и Б), |
||
соединенных дисульфидной связью. |
В структуре молекулы тромбина кроме |
||
активного центра, в который входит |
триада каталитического участка активного |
||
центра – Гис 57, Асп 102 и Сер 195, отмеченные *, |
и участки первичного и |
||
вторичного связывания ( в том числе D189 первичного связывающего участка, |
|||
локализованного на дне каталитического кармана) |
обнаружены |
экзосайты, |
|
экспонированные на поверхности молекулы: анионсвязывающий |
экзосайт 1 |
||
(АВЕ1), экзосайт 2 (АВЕ 2), и сайт связывания ионов Nа . |
Экзосайты |
||
локализованы вне активного центра молекулы. |
|
|
|
А-цепь тромбина быка содержит 49 ао, а у тромбина человека она укорочена на 13 ао с N-конца молекулы. Б-цепи обоих тромбинов почти идентичны и состоят из 259 остатков. Структура Б-цепи тромбина поддерживется тремя дисульфидными связями. Выявлена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности тромбина и родственных протиназ – трипсина и химотрипсина в тех частях молекулы, где локализованы аминокислоты триады каталитического участка активного центра – Гис 57, Асп
102 и Сер 195, образующие систему переноса заряда. Активность тромбина, как
идругих сериновых протеиназ, подавляется диизопропилфторфосфатом (ДФФ)
итозиллизилхлорметилкетоном, избирательно блокирующими, соответственно,
серин и гистидин активного центра.
Тромбин и трипсин имеют одинаковую первичную специфичность: они
расщепляют эфирные,амидные и пептидные связи основных аминокислот– аргинина и лизина. Но тромбину, в отличие от трипсина, свойственна
избирательность при отборе субстратов и расщепляемых связей. |
Он не |
|
92 |
гидролизует обычные субстраты протеиназ такие, как казеин, гемоглобин,
альбумин, а проявляет специфичность высшего порядка в выборе субстратов и гидролизуемых связей.
В отличие от трипсина тромбин-узкоспецифичная протеиназа, тк
расщепляет только одну или несколько связей в своих специфических
субстратах ( факторах V и VIII, фибриногене и др) и рецепторах, активируемых протеиназами ( PAR-1и PAR-4).
Высокая специфичность тромбина в отношении определенных субстратов и рецепторов клеток обеспечивается определенными участками в структуре
тромбина, так называемыми экзосайтами, экспонированными на поверхности молекулы: анионсвязывающим экзосайтом 1(АВЕ1) ( называемым также центром узнавания субстратов и рецепторов) и экзосайтом 2 (рис. 2-25).
Экзосайты локализованы вне активного центра на поверхности молекулы.
Анионсвязывающий экзосайт 1 отвечает за взаимодействие тромбина с комплементарными участками рецепторов клеток (тромбомодулином
эндотелия, PAR,) и специфических субстратов (фибриногена, факторов VIII,V,
кофактора II гепарина). Анионсвязывающий экзосайт 2 обеспечивает связывание тромбина с гепарином, ГПIba тромбоцитов. В области
анионсвязывающего экзосайта 1 происходит взаимодействие тромбина с его высокоспецифическим экзогенным ингибитором - гирудином. Гирудин (7kDa)–
полипептид |
из |
секрета слюнных желез |
медицинской пиявки (Hirudo |
|||
medicinalis), |
который |
в |
пикомолярной |
концентрации |
блокирует |
|
протеолитическую |
активность |
фермента с |
константой ингибирования Ki |
|||
равной 10-13 . |
|
|
|
|
|
|
Для расщепления тромбином менее специфических субстратов , таких как протеин С, TAFI (ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином), факторы свертывания крови XI и XIII ( фибринстабилизирующий фактор) необходимо предварительное связывание тромбина через экзосайты молекулы с кофакторами, каковыми могут быть специфические рецепторы или субстраты.
Предварительное специфическое взаимодействие тромбина с кофакторами вызывает аллостерические конформационные изменения молекулы фермента,
облегчающее разщепление не специфических субстратов тромбина.
Так, для эффективной реакции активации тромбином протеина С и TAFI
необходимо связывание фермента через его АВЕ1 с рецептором на эндотелии
93
тромбомодудином (ТМ). Для активации тромбином фактора XI свертывания крови необходимо предварительное взаимодействие АВЕ2 молекулы фермента с рецептором тромбоцитов ГП Iba. Для эффективной активации фактора XIII
тромбин должен сначала связаться через его АВЕ1 с фибриногеном, чтобы затем расщепить определенные пептидные связи в молекуле фактора XIII.
C помощью |
рентгеноструктурного |
анализа |
и сайт-направленного |
|
мутагенеза выявлены конформационные изменения, |
происходящие в молекуле |
|||
тромбина при связывании |
иона Na, которые приводят к повышению скорости |
|||
расщепления |
фибриногена и других |
прокоагулянтных специфических |
||
субстратов и рецепторов ( |
рис 25,26). |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
94
Рис 2-26.
Изменение функций тромбина при связывании ионов Nа и аллостерическом изменении молекулы фермента
При физиологических условиях (145 мМ NaCl) существуют обе формы.
Быстрая форма тромбина связывает фибриноген с высоким сродством и гидролизует его с более высокой скоростью, чем медленная. Медленная форма тромбина более специфично активирует антикоагулянт - протеин С.
Аллостерические изменения конформации молекулы тромбина могут определять его прокоагулянтные или антикоагулянтные функции.
Идентифицированы участки связывания Na+. Структурный переход молекулы тромбина при связывании Nа+ вызывает аллостерическое конформационное изменение молекулы от «медленной» (свободной от Na+)
формы к «быстрой» (cвязанной с Na+). При физиологических условиях (145
мМ NaCl) существуют обе формы. Быстрая форма тромбина связывает фибриноген с более высоким сродством и гидролизует его с более высокой скоростью (kcat/Km), чем медленная. В то же время медленная форма тромбина более специфично активирует антикоагулянт - протеин С. Точечная замена Trp60D в молекуле тромбина вызывала снижение связывания Na+ и
сдвиг в медленную форму, что приводило к повышению антикоагулянтной активности тромбина. Таким образом, аллостерические изменения конформации молекулы тромбина могут определять его прокоагулянтные или антикоагулянтные функции.
Высокая специфичность тромбина впервые продемонстрирована на примере его основного субстрата фибриногена, у которого тромбин гидролизует только четыре аргинил(Арг)-глициновые(Гли) связи из 387 доступных трипсину. Катализ образования фибриновых сгустков -наиболее известная и лучше других изученная биологическая функция тромбина.
2.4.2 Превращение фибриногена в фибрин
Фибриноген-крупная молекула состоит из трех пар полипептидных цепей-А
альфа,В бета,гамма, об`единенных в три домена DED. Тромбин гидролизует
95
Арг-Гли связи сначала в А альфа цепях, а затем в Вбета цепях, так что от каждой молекулы фибриногена сначала отщепляются два небольших фибринопептида А, а затем два фибринопептида В( рис.2- 27).
Рис 2-27.
Схема превращения фибриногена в фибрин
Тромбин отщепляет от |
каждой молекулы фибриногена сначала два |
фибринопептида А, а затем |
два фибринопептида В, и образуется фибрин- |
мономер, который имеет тенденцию к спонтанной полимеризации в большие мультимолекулярные аггрегаты. Сборка агрегатов начинается с латерального соединения мономеров фибрина со смещением на 1/2 длины молекулы.
Образуется первичный димерпротофибрилла. Далее происходит самосборка протофибрилл, образование пучков волокон и стабилизация с помощью изопептидных связей между боковыми цепями остатков глутаминовой кислоты
(Глу ) и лизина (Лиз ) смежных гамма цепей молекул.
96
Образуется фибрин-мономер, который имеет тенденцию к спонтанной полимеризации в большие мультимолекулярные аггрегаты. Эта тенденция
возникает вследствие экспозиции центров сборки на амино(N)конце E
домена,комплементарных центрам сборки, которые всегда присутствуют в
домене D. Сборка начинается с латерального соединения мономеров фибрина
со смещением на 1/2 длины молекулы.Образуется первичный димер-
протофибрилла, мономеры в которой соединены конец к середине. Далее
происходит самосборка протофибрилл, образование пучков волокон и
стабилизация с помощью изопептидных (ковалентных) связей между боковыми цепями остатков глутаминовой кислоты (Глу ) и лизина (Лиз ) смежных гамма цепей молекул. Эту реакцию катализирует фактор XIII свертывания крови -
фибринстабилизирующий фактор или Са-зависимая трансгутаминаза. Он
циркулирует в крови в форме |
предшественника, |
активируемого тромбином |
или фактором Xa. Тромбин |
расщепляет сначала |
- цепи и освобождает |
активационный пептид, а затем тетрамер фактора XIII распадается с образованием активной формы, состоящей из двух ’- цепей.
2.4.3. Полифункциональность тромбина
Тромбин-полифункциональный фермент и его высокая избирательность действия проявляется во всех его физиологических функциях. Тромбин участвует в регуляции процессов, направленных как на ускорение свертывания крови так и на его торможение (рис. 2-20, 2-23,2- 28).
97
РИС 2-28
Полифункциональность тромбина.
Тромбин участвует в регуляции процессов: ускорения свертывания крови
иего торможения; воспаления, пролиферации клеток, ангиогенеза,
заживления ран и многих других физиологических процессах.
Регулируя процессы положительной обратной связи тромбин активирует факторы V,VIII,XI и XIII свертывания крови, стимулирует экспрессию тканевого фактора, адгезивных белков на поверхности поврежденного эндотелия и моноцитов, адгезию к эндотелию клеток крови, индуцирует агрегацию тромбоцитов. Регулируя процессы отрицательной обратной связи тромбин взаимодействует с тромбомодулином эндотелия и активирует протеин С, который ограничивает образование тромбина инактивируя факторы Va и VIIIa.
Связанный с тромбомодулином тромбин блокирует фибринолиз, поскольку активирует ингибитор фибринолиза, активируемый тромбином ( TAFI) в TAFIa
98
- карбоксипептидазу , которая отщепляет карбоксиконцевые остатки лизина и аргинина от молекул фибрина, тем самым лишая его возможности связывать плазминоген-профермент плазмина . Плазминоген не способен к иммобилизации на дефектном фибрине и не образует плазмин - фермент расщепляющий фибрин.
Вместе с тем, тромбин стимулирует освобождение из эндотелия сосудов
ингибитора агрегациипростациклина, тканевого активатора плазминогена и
его ингибитора. Тромбин - вовлекается в реализацию ряда физиологических и патофизиологических процессов, таких как регуляция сосудистого тонуса,
заживления ран,имунного ответа, процессов воспаления, атерогенеза,развитие
новообразований,болезни Альцгеймера, и др. Эти реакции обусловлены
рецептор-опосредованной активацией тромбином клеток крови,соединительной
и нервной тканей: кровяных |
пластинок, моноцитов, |
полиморфноядерных |
лейкоцитов,фибробластов,клеток |
эндотелия, |
гладкомышечных, |
нервных,тучных и многих других. Тромбин вызывает экспрессию на
поверхности поврежденного эндотелия факторов роста, адгезивных
белков,прежде всего фактора фон Виллебранда и селектинов Р и Е, которые отвечают за прикрепление клеток крови к эндотелию. Тромбин включается в процессы миграции клеток, агрегации, пролиферации и изменяет проницаемость эпителиального слоя. Тромбин играет роль дирижера клеточных ответов.
За высокую специфичность тромбина в отношении рецепторов клеток и субстратов отвечают особые участки молекулы тромбина, экзосайты центра узнавания: АВЕ1 и ABE2, связывающиеся с комплементарными участками в структуре рецепторов и субстратов , а также сайт связывания ионов Na ( рис.2- 22,2-23).
Тромбин и другие протеиназы активируют клетки через новое семейство рецепторов, называемых - рецепторы активируемые протеазой -PAR.
3.4. Рецепторы, активируемые протеиназами (PAR)
Впервые рецептор тромбина на мембране клеток, названный PAR
(рецептор, активируемый протеазами) обнаружен как в 1991г в лабораториях Кохлина ( Coughlin ) в США и Обберген-Шиллинг (van Obberghen-Schilling)во
99
Франции. PAR – класс семейства семидоменных рецепторов, сопряженных с
G-белками, с уникальным механизм активации. Тромбин расщепляет одну пептидную связь во внеклеточном домене рецептора и освобождает новый N-
концевой участок рецептора, так называемый «привязанный лиганд», который служит агонистом рецептора (рис229). Привязанный лиганд взаимодействует с доменом второй внеклеточной петли рецептора и запускает активацию клеток-
эффекторов.
Известны четыре подтипа этого семейства –PAR-1, PAR-2, PAR-3 и
PAR-4 (табл.5,рис.2- 29).
РИС 2-29
100