2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Санитарно_бактериологический_контроль_и_микробиологические_методы

51

нитриф ициру ю щ их и аммониф ициру ю щ их б актерий, актиномицетов, гриб ов, целлю лозных и дру гих микроорганизмов.

За д а ния д л я вы по л нения л а бо р а т о р но йр а бо т ы

1.О п ределить микроб ноечислоп очвы, сделать заклю чение.

2.Провестиоценку санитарно-б актериолоrическогосостоянияп очвы

п о резу льтатам оп ределения коли-титра, п ерф рингрнс-титра и титра термоф ильных б актерий.

М ет о д ическиеука за ния О пр ед ел ениемикр о бно го числ а по чвы

Почву б еру тнаглу б ине10-15 см стерильным нож ом (из разных мест исследу емой территории не менее 10 п роб ) и п омещ аю т встерильну ю б анку . И з п роб готовятнавеску (30 г), котору ю вносятвколб у с водой (270 мл) и тщ ательно встряхиваю т. И з п олу ченной су сп ензии готовят

разведения l0-3, l0-4, 10-5. И з дву х п оследних разведений б еру т 0,1 мли

смеш иваю т с 40 мл 0,7 % расп лавленного и осту ж енного до 45 °С п итательного агара, п ослечего выливаю твторым слоем вчаш ки Петри с

2% п итательным агаром. Посевы инку б иру ю т п ри 37 °С. Затем п одсчитываю т количество выросш их колоний и оп ределяю т микроб ное

Различные разведения п очвенной су сп ензии засеваю т п о 1 мл в

п роб ирки со средой К есслераи инку б иру ю тп ри 43 °С втечение48 ч. В дальнейш ем анализ п роводят п о схеме, п рименяемой п ри оп ределении коли-титраводы.

Д ля оп ределения п ерф рингенс-титра различные разведения п очвенной су сп ензии п о 1 мл засеваю т в п роб ирки со стерильным об езж иренным молоком или ж елезосу льф итной средой В ильсона-Блера.

Посевы инку б иру ю тп ри 43 °С втечение24 - 48 ч., п ослечегоу читываю т резу льтаты п о свертыванию молокаили п о об разованию черных колоний Сlо stridium р еrfringеns вагаровом столб ике среды В ильсона-Блера. И з

грамп олож ительных б актерий.

Железосу льф итнаясредаВ ильсона-Блера: 3 % п итательногоагара, 1

%глю козы, 2 % су льф итанатрия, 0,08 % хлоридаж елеза.

Д ля оп ределения титратермоф ильных б актерий разведения п очвенной су сп ензии п о 1 мл вносят вчаш ки Петри, заливаю т расп лавленным и охлаж денным п итательным агаром. Посевы инку б иру ю т втечение су ток

п ри 60 °С, а затем п одсчитываю т количество выросш их колоний и п ересчитываю тна1 гп очвы.

52

Санитарно-микроб иологическу ю оценку п очвы п роизводят п о комп лексу п оказателей, из которых наиб олее важ ным является

установлениестеп ени ф екальногозагрязнения(таб л. 7).

Таблица 7. О ценка санитарного состояния п очвы п о основным микроб иологическим п оказателям

М ет о д ическиеука за ния

О б ъ ектами б иологических исследований являю тся:

1.В одадистиллированная.

2.И нъ екционныерастворы достерилизации.

3.И нъ екционныерастворы п ослестерилизации.

4.Глазные кап ли, п риготовленные настерильных растворах и п осле стерилизации.

5.Су хие лекарственные вещ ества, исп ользу емые для п риготовления инъ екционных растворов.

6. А п течная п осу да, п роб ки, п рокладки, п рочие всп омогательные материалы.

7.И нвентарь, об ору дование, ру ки и санитарнаяодеж дап ерсонала.

Возду ш наясреда.

О тб ор п роб для исследования п роводят сотру дники санитарноэп идемиологических станций или раб отники б актериологической лаб оратории. К ратность об следований с отб ором п роб составляетнеменее 2-х раз вквартал.

1. Иссл ед о ва ниед ист ил л ир о ва нно йво д ы :

а ) О пр ед ел ение ко л ичест ва мезо фил ьны х а эр о бны х и фа кул ьт а т ивны х

ана эр о бны х ба кт ер ийв 1 см3 д ист ил л ир о ва нно йво д ы .

Исследу ему ю воду вносятп о1 см3 вдвеп араллельныечаш ки Петри, которыезатем заливаю тп итательным агаром и выдерж иваю т24 часап ри

п итательногоагара. При вычислении резу льтатованализавыводятсреднее ариф метическоеиз числаколоний, выросш их наоб еих чаш ках.

53

б) Дл я вы явл ения пл есневы х и д р о ж ж евы х гр ибо в засеваю т п о 0,5 см3

исследу емой воды нап оверхность дву х чаш ек Петри со средой Саб у ро и

инку б иру ю т п ри темп ерату ре 20 - 22 °С втечение 3 - 4 су ток. Затем п одсчитываю т число колоний п лесневых и дрож ж евых гриб овнаоб еих чаш ках.

О п ределениетитраб актерий гру п п ы киш ечной п алочки (М етодика действу ю щ егоГосстандарта18963-73 «В одап итьевая, М етоды санитарно-

выращ иваю тп ри темп ерату ре37 °С втечение18 - 24 часовс дальнейш им

часть колоний п ересеваю т на глю козо-п еп тонну ю среду с п оп лавком,

инку б иру ю тп ри37 °С втечение18 - 24 часов. Н аличиекислоты и газана глю козо-п еп тонной среде об у словливает содерж ание б актерии гру п п ы киш ечных п алочек.

в) Ко л ичест венно ео пр ед ел ениеба кт ер ии гр уппы кишечны х па л о чек. 1 г

(см3) лекарственных средствзасеваю тначаш ку и заливаю тсредой Э ндо, т.е. п рименяю т глу б инный метод п осева. После инку б ации п осевовп ри

темп ерату ре37 °С втечение18 - 24 часову читываю тколонии тип ичные дляб актерий гру п п ы киш ечнойп алочки.

концентраций инъ екционным растворам и глазным кап лям изготовляемым

54

вап теках. О б ъ ем и методикаисследованияп риготовленных растворовсм. п у нкт2.

Резу льтаты п олу ченные п ри исследовании су хих вещ еств в растворах долж ны соответствовать треб ованиям п рилож ения п риказа№

п оследовательнооп оласкиваю тв10 см3 стерильной водоп роводной воды. В оду из ф лаконавоф лакон п ереливаю тнадп ламенем горелки, тщ ательно сп оласкиваякаж дый ф лакон.

В б анки или ш ирокогорлые колб ы с доставленными п роб ками и п рокладками наливаю т 10 см3 стерильной водоп роводной воды и тщ ательносп оласкиваю т.

В смы вно йж ид ко ст и пр о во д ят о пр ед ел ение:

а ) ко л ичест ва мезо фил ьны х а эр о бны х и фа кул ьт а т ивно а на эр о бны х ба кт ер ий (см. п у нкт1а). Ч исло колоний, у становленноев1 см3 смывной ж идкости, у множ аю т на10, что соответству ет содерж анию б актерий на всейсмывш и п оверхности 3-х одноименных п редметов;

б) о пр ед ел ение на л ичия ба кт ер ий гр уппы кишечны х па л о чек 8 см3

3

оставш ейся смывной ж идкости засеваю т в 1 мл концентрированной

глю козо-п еп тонной среды и инку б иру ю тп ри темп ерату ре37 °С втечение 18 - 24 часов. Д альнейш ий ход исследованияи идентиф икацию б актерий гру п п ы киш ечных п алочек п роводятп оп у нкту 2б .

Инт ер пр ет а ция р езул ьт а т о в ба кт ер ио л о гических иссл ед о ва ний:

п рокладок (т. е. в10 см3 смывной ж идкости); - б актерии гру п п ы киш ечнойп алочки недоп у скаю тся.

5. М ет о д ика иссл ед о ва ния во зд уха

Д оставленные чаш ки с п осевами на п итательном агаре и Ж СА

инку б иру ю твтермостатеп ри 37 °С втечение24 часов, п осевы наЖ СА доп олнительновыдерж иваю тещ е24 часап ри комнатнойтемп ерату ре.

Посевы насредеСаб у роинку б иру ю тп ри темп ерату ре22 - 28 °С- 4 су ток. Д ля оп ределения об щ ей б актериальной об семененности через 48 часов п осевы п росматриваю т, п одсчитываю т количество выросш их колоний и

п роизводятп ересчетна1 м3.

Д ля оп ределения количественного содерж ання золотистого стаф илококкап росматриваю т п осевы нап осле 48-ми часовинку б ации, колонии п одозрительные на стаф илококк п одсчитываю т и п роводят идентиф икацию . Послеидентиф икации п роизводятп ересчетп олу ченных

55

резу льтатовна1 м3 возду ха(Прилож ение№ 2 к п риказу М инздраваСССР

№720 от31. 07. 78 г.)

Для количественного оп ределения п лесневых и дрож ж евых гриб ов

после96 часовой инку б ации п одсчитываю тколичествовыросш их колоний

плесневых и дрож ж евых гриб овп роизводятп ересчетна1 м3.

6. Иссл ед о ва ниесмы во в

О риентировочный п еречень об ъ ектов, п одлеж ащ их контролю методом смывов:

1.Раб очееместодеф ектара.

2.Столдляп риготовленияинъ екционных растворов.

3.Столдляп риготовленияглазных кап ель.

4.В есы длявзвеш иваниясу хих вещ еству деф ектара.

5.Т арадля хранения п рокладок и п роб ок, исп ользу емых для у ку п орки инъ екционных растворовиглазных кап ель.

6.Сту п ки.

7.Пластинки п ластмассовые.

8.В есы роговые.

9.К ранводоп роводный вассистентской.

10.Ру ки п ерсонала.

11.Полотенце.

12.Санодеж да.

Объем иссл ед о ва ния:

а) оп ределениеб актерий гру п п ы киш ечных п алочек.

Т амп он со стеклянной п алочкой п омещ аю т всреду К есслераили К ода. Д альнейш ий ход исследования и идентиф икацию п роводят п о об щ еп ринятойметодикеисследованиясм. п у нкт1б , в.

б ) оп ределениеп атогенных (золотистых) стаф илококков(п о п оказаниям) осу щ ествляю т п у тем п осевасмывовж идкости вп роб ирку с 5 см3 6,5%

Инт ер пр ет а ция р езул ьт а т о в:

Бактерии гру п п ы киш ечной п алочки и п атогенные стаф илококки в

56

В сеимму номикроб иологическиеметоды (И М ) мож норазделить на3

антителом (реакции неп рямой гемагглю тинации, коагглю тинации, латекс-

б актерий и дру гих корп у ску лярных частиц с антителами и п ротекаетвдве

(невидимая ф аза); 2) несп ециф ическая (видимая) ф азаоб разу ю щ ийся комп лекс (А Г+А Т ) у трачиваетрастворимость и вып адаетвосадок ввиде хлоп ьев. О днако это явление возмож но лиш ь в электролитной среде, нап ример в0,85 % растворенатрияхлорида.

РА мож но п рименять для об нару ж ения сп ециф ических антителв сывороткекрови и, наоб орот, п ри п омощ и стандартной агглю тиниру ю щ ей сыворотки мож ноидентиф ицировать выделенныемикроб ы.

О р иент ир о во чна я Р А д л я ид ент ифика ции микр о ба

Реакция слу ж ит для п редварительного оп ределения видамикроб а. Н ап редметноестекло наносяткап лю у зкосп ециф ичной адсорб ированной сыворотки (т.е. сыворотку , содерж ащ у ю толькосп ециф ическиеантитела). Сыворотку наносят вразведении 1:10 и рядом кап лю ф изиологического

хлоп ьевнаф онеп розрачной ж идкости. В контролеравномернаяму ть.

К роме сп ециф ической агглю тинации б актерий, вызванной антителами, возмож насп онтаннаяагглю тинация(вотсу тствиеимму нной сыворотки).

осаж даю щ иесяввидеклеточных агрегатов. При кислой реакции среды в резу льтате снятия одноименного зарядас п оверхности б актериальных клеток визоэлектрической зонетакж еп роисходитсклеиваниенасту п ает

ставятконтрольну ю п роб у с изотоническим раствором хлориданатрия.

57

Р еа кция непр ямо йгема ггл ют ина ции

РН ГА являетсясвоеоб разной модиф икацией РА . Су щ ность реакции состоит втом, что молеку лы антигенаадсорб иру ю тся нап оверхности эритроцитов. Т акие"нагру ж енные" антигенами эритроциты п риоб ретаю т сп особ ность агглю тинироватьсяимму нной сывороткой, сп ециф ичной для данногоантигена. Э ритроциты склеиваю тсяи вып адаю твосадок, об разу я

мл заведомо п олож ительной сыворотки и в п оследню ю 0,5 мл ф изиологического раствора(контроль). Затем во вселу нки доб авляю тп о

сп особ ность эксп ресс-индикации антигеновсоставляет несколько тысяч микроб ных телв1 мл.

58

Реа кция пр еципит а ции в гел е

Имму нодиф ф у зия вагаровом геле растворовантигенови антител, залитых вразныелу нки, навстречу дру гдру гу вслу чаях соответствияих

сп ециф ичности п риводит к об разованию сп ециф ического п рецип итатав

соответству ю щ ей сп ециф ичности, авдру гу ю - нормальнаясывороткадля

контроля. Проводитсяинку б ациявовлаж ной камереп ри 37 °С втечение 24 ч. У читываю т количество и ш ирину п олос п рецип итации меж ду центральной лу нкой с раствором антигенаи лу нками с исследу емыми сыворотками.

Р еа кция л изиса . Р еа кция связы ва ния ко мпл емент а

Д ляп остановки реакции лизисаи реакции связываниякомп лемента (РСК ) исп ользу ю т комп лемент, который содерж ится всыворотке крови морских свинок. Гемолитическаяактивность комп лементатермолаб ильна и п олностью у трачиваетсяп ри п рогревании сыворотки втечение30 мин.

п ри 56 °С. При адсорб ции комп лементанакомп лексеантиген - антитело его действие п роявляется реакцией лизиса антигена, если антиген

изотоническом растворе хлориданатрия и гемолитической сыворотки кролика, п олу ченной п у тем егоимму низации у п омяну тыми эритроцитами. Полож ительная РСК характеризу ется задерж кой гемолиза вследствие адсорб ции комп лементасистемой антиген - антитело. О трицательнаяРСК характеризу ется наличием гемолиза, п оскольку своб одный комп лемент связывается с системой эритроциты б аранагемолитическая сыворотка кролика. РСК об ладает высокой чу вствительностью и сп ециф ичностью , чтоп озволяетисп ользовать еедлясеродиагностики многих заб олеваний.

Д ляп остановки РСК треб у етсяточноеоп ределениеколичественных соотнош ений всех ингредиентов, у частву ю щ их вреакции: исследу емой сыворотки, антигена, комп лемента, гемолитической сыворотки кроликаи эритроцитовб арана. Поэтому п остановкеосновного оп ытап редш еству ет титрование гемолитической сыворотки и выб ор ее раб очего разведения,

59

смеси (смеси равных об ъ емов3 % су сп ензии эритроцитоввизотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки в разведении,

соответству ю щ ем еетройному титру ). Проб ирки выдерж иваю тп ри 37 °С и через 30 мин. оп ределяю т титр комп лементанаиб ольш ееразведение комп лемента, котороевызываетп олный лизис эритроцитоввп рису тствии гемолитической сыворотки. Раб очу ю дозу комп лементарассчитываю т, исходяиз его титра. Раб очаядозакомп лементадолж наб ыть выш етитра на25 %. Т ак, нап ример, п ри титрекомп лемента1:20 вкачествераб очей дозы б еру тегоп редыду щ ееразведение1:10.

Ант игены изготавливаю тсяиз взвесей у б итых микроорганизмов, их лизатов, п олных антигенов, гап тенов, экстрактовтканевых лип идов.

Взвесьэр ит р о цит о в б аранап олу чаю тиз деф иб ринированной крови б арана, отмываяэритроциты изотоническим раствором хлориданатриядо п олу ченияп олнойб есцветностиип розрачностинадосадочной ж идкости и готовятиз них 3 % взвесь визотоническом растворехлориданатрия.

и инактивиру етсяп ри 56 °С (разру ш ен комп лемент). Н аэтикеткеамп у лс сывороткой об означен ее титр - максимальное разведение данной сыворотки, котороеоб есп ечиваетп олный лизис 3 % взвеси эритроцитов

б аранавп рису тствии комп лементап ри 37 °С втечение часа. Д ля РСК

беру тгемолитическу ю сыворотку втройном титре.

По ст а но вка о сно вно г о о пы т а Р СК

Послеу становления титраи раб очих доз всех ингредиентовставят основной оп ыт РСК . И сп ыту ему ю и контрольные сыворотки

п редварительно инактивиру ю тнагреванием п ри 56 °С втечение30 мин. Стандартная схемап остановки РСК п реду сматриваетп роведение п ервой ф азы инку б ации смеси антигенаисп ыту емой сыворотки и комп лемента

п ри 37 °С втечение 30 мин. При п остановке РСК нахолоде эту ф азу п роводятп ри 0 - 4 °С втечение18 - 20 ч., чтоп овыш аетчу вствительность реакции.

После доб авления вкаж ду ю п роб ирку п о 0,4 млгемолитической

системы п роб ирки встряхиваю ти выдерж иваю т20 - 30 мин. п ри 37 °С. Резу льтаты оп ытаоцениваю т, отмечаяналичиеилиотсу тствиегемолизаво всех п роб ирках.

Реакцию считаю т п олож ительной п ри п олной задерж ке гемолиза, когдаж идкость вп роб ирке б есцветнаи эритроциты оседаю т надно, отрицательной - п ри п олном лизисе эритроцитов, когда ж идкость интенсивно окраш ена («лаковая кровь» ). Степ ень задерж ки гемолиза оцениваю твзависимости отинтенсивности окраски ж идкостиивеличины осадкаэритроцитовнадне( + + + + , + + + , +).

В качестве контроля (2-я и 3-я п роб ирки) у читываю т реакцию с заведомо п олож ительной и заведомо отрицательной сыворотками; 4-яи

60

5-я п роб ирки слу ж ат для п роверки антикомп лементарных свойств сыворотки и антигена; в6-й и 7-йп роб ирках контролиру ю тсяраб очаядоза комп лементаикачествогемолитическойсистемы.

Р еа кция Кумбса

Слож ность выявлениянеп олных (моновалентных) антителсвязанас тем, чтоэти антитела, связываясь с эп итоп ами сп ециф ическогоантигена,

дру гими тестами. Д ля выявления об разовавш ихся комп лексовантиген - антитело п риходится исп ользовать доп олнительные тест-системы. Д ля выявления неп олных антител, нап ример к резу с-антигену эритроцитовв сывороткекрови б еременной ж енщ ины, реакцияставитсявдваэтап а: I) к дву кратным разведениям исп ыту емой сыворотки доб авляю тэритроциты,

содерж ащ иерезу с-антиген, и выдерж иваю тп ри 37 °С втечениечаса; 2) к

оттитрованном раб очем разведении). Послеинку б ации втечение30 мин.

об раб отанные нормальной сывороткой эритроциты -f- антиглоб у линовая

считается имму ноф ерментный анализ (И Ф А ), который не у сту п ает п о чу вствительности радиоимму нному анализу (РИ А ) и в то ж е время отличаетсяотнегоб ольш ей досту п ностью дляоб ычных диагностических лаб ораторий. Сп ециф ический антиген адсорб иру ю тнап оверхности лу нок в п ластинах из п олистирола (п оливинилхлорида). Ф иксированный на

иммоб илизованными антигенами имму ноглоб у лины выявляю тс п омощ ью антивидовой (античеловеческой) антиимму ноглоб у линовой сыворотки, к антителам которой ковалентно п рикреп лен ф ермент-п ероксидаза. После

количеству сорб ированных наантигенеантител, мож нооценить визу ально или с п омощ ью сп ектроф отометра. В данной модиф икации у доб на у ниверсальность меченогореагента, который п озволяетвыявлять антитела к разным антигенам.