2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Санитарно_бактериологический_контроль_и_микробиологические_методы

11

сгиб ательными изменениями клеток. Под клеточной стенкой сп ирохет находится аксиальная нить (аксистиль), которая как б ы закру чивается вокру г п ротоп лазматического цилиндра сп ирохеты, п ридавая ей винтооб разну ю ф орму (п ервичные завитки сп ирохет). А ксиальная нить состоитиз ф иб рилланалоговж гу тиковб актерий и п редставляетсоб ой сократительный б елок ф лагеллин. Ф иб риллы у частву ю т вп ередвиж ении

сереб рением. В ж ивом видеих исследу ю тс п омощ ью ф азово-контрастной

возб у дитель троп ической б олезни - ф рамб езии. И мею тся и сап роф иты - об итатели п олости ртаи илаводоемов.

В озб у дитель возвратного тиф а В.rесиrrепti является п атогенным п редставителем рода Во rrеliа . Патогенный п редставитель L.iпtеrrо gа пs вызывает леп тосп ироз. Патогенные леп тосп иры п оп адаю т ворганизм с водой или п ищ ей, п риводя к развитию кровоизлияний и ж елту хи. Сап роф итныеп редставителиоб итаю твводе.

4. Р иккет сии - мелкиеграмотрицательныеп алочковидныеб актерии размером 0,35 - 2,0 мкм, об лигатныевну триклеточныеп аразиты. О б итаю т вчленистоногих, которые являю тся их хозяевами или п ереносчиками. Своеназваниериккетсии п олу чили вчесть Х .Т .Риккетсаамериканского у ченого, вп ервые оп исавш его одного из возб у дителей (п ятнистая лихорадкаСкалистых гор). Ф ормаи размер риккетсии могу т меняться

ку риногоэмб риона, п ереж иваю щ их ку льту рах клеток и тканях ж ивотного. Риккетсии об ладаю т независимым от клетки хозяина метаб олизмом, однако, возмож но, они п олу чаю т от клетки-хозяина макроэргические соединениядлясвоегоразмнож ения. В мазках и тканях их окраш иваю тп о методу Романовского-Гимзы или п оЗдродовскому . У человекариккетсии

вну триклеточным кокковидным грамотрицательным б актериям. Геном хламидий содерж итв4 разаменьш егенетической инф ормации, чем геном киш ечной п алочки. Х ламидии размнож аю тсятольковж ивых клетках: их

12

рассматриваю т как энергетических п аразитов. По-видимому , у хламидий отсу тству ет система регенерации А Т Ф . В не клеток хламидии имею т сф ерическу ю ф орму (0,3 мкм), являясь элементарными тельцами. В ну три клеток они п ревращ аю тся в делящ иеся ретику лярные тельца, об разу я

урогенитальноготрактаидр.

6.М ико пл а змы - мелкиеб актерии, окру ж енныецитоп лазматической мемб раной и не имею щ ие клеточной стенки. О ни относятся к отделу

микоп лазм. Н ап лотнойп итательнойсредемикоп лазмы об разу ю тколонии, нап оминаю щ ие яичницу -глазу нью : неп розрачная центральная часть, п огру ж енная в среду , и п росвечиваю щ ая п ериф ерия в виде кру га. Патогенные микоп лазмы вызываю т хронические инф екции, нап ример, М усо р lа sт а р пеит о пiа евызываету человеказаб олевание, п ротекаю щ ееп о

родовСо rупеbа сtеriит , М усо bа сtеriит , Nо са rdiа и др. Н окардиоп одоб ные актиномицеты отличаю тся наличием в клеточной стенке сахаров араб инозы, галактозы, атакж е миколовых кислот и б ольш их количеств

За д а нuя д л я вы nо л ненuя л а бо р а т о р но йр а бо т ы

1. О п ределить ф орму клеток неизвестной б актериальной ку льту ры, исп ользу яп ростойметодокраски.

2. О п ределить ф орму клеток иотнош ениек окраскеп оГраму разных б актерий, содерж ащ ихсявисследу емойсмеси б актериальных ку льту р.

13

3. О п ределить наличиесп ор, зерен волю тинаи кислотоу стойчивость

(п риж изненные) п реп араты и ф иксированныемазки, которыеокраш иваю т анилиновыми красителями. В основеокраски леж атслож ныеxимические и ф изико-xимические реакции. Ц итоп лазма б актерий, особ енно в

фиксированныx мазкаx, об ладает сродством к основным красителям, вследствиечего окраску п роводятметиленовым синим, кристаллическим

фиолетовым, везу вином идр.

заклю чаю тсявокраскеп реп аратаодним красителем; слож ныеметоды (п о Граму , Ц илю -Н ильсену и др.) вклю чаю тп оследовательноеисп ользование несколькиx красителей и имею т диф ф еренциально-диагностическое значение. О тнош ение микроорганизмовк красителям расцениваю т как

п редметно стекло с лу нкой, края которой п редварительно смазываю т вазелином, п риж имаю тк п окровному стеклу так, чтоб ы кап лянаходилась вцентрелу нки. Быстрым движ ением п ереворачиваю тп реп аратп окровным стеклом вверх. В п равильно п риготовленном п реп арате кап ля долж на своб одновисеть надлу нкой, некасаясь ееднаили края. Д лямикроскоп ии вначалеисп ользу ю тмалый су xой об ъ ектив8X, п оду величением которого наxодят край кап ли, азатем у станавливаю т об ъ ектив40X и исследу ю т п реп арат.

су сп еп зию б актерий и п окрываю т ее п окровным стеклом. К ап ля долж на б ыть неб ольш ой, не выходящ ей за край п окровного стекла.

Микроскоп иру ю тп реп аратс об ъ ективом 40X.

Пр иж изненна я (вит а л ьна я) о кр а ска . В звесь микроорганизмоввносят вкап лю 0,001% раствораметиленовогосинегоилинейтральногокрасного.

Затем готовят п реп арат «висячая» или «раздавленная» кап ля и микроскоп иру ю т. После микроскоп ии п реп араты «раздавленной» или «висячей» кап ли оп у скаю твдезинф ициру ю щ ий раствор.

П р иго т о вл ениефиксир о ва нны x пр епа р а т о в-ма зко в

Д ля п риготовления п реп аратанаоб езж иренное п редметное стекло

содерж ится вж идкой среде, то его неп осредственно наносят п етлей на п редметноестекло и готовятмазок. М азки высу ш иваю тнавозду хеили в стру етеп логовозду ханадп ламенем горелки, недаваякап лезакип ать.

Д ля ф иксации мазкап редметное стекло (мазком вверх) медленно п роводят 3 разачерез п ламя горелки. М икроорганизмы п ри ф иксации п огиб аю т, п лотноп рикреп ляясь к п оверхностистекла, и несмываю тсяп ри дальнейш ейоб раб отке. Прогретыемикроорганизмы б олеевосп риимчивы к

Никиф орова, су лемовый сп иртили дру гиеф иксиру ю щ иеж идкости.

Мет о д ы о кр а ски ма зко в

П р о ст о й мет о д . Ф иксированный мазок окрасить каким-либ оодним

оп ределенныекрасители, различаю щ иесяп охимическому составу и цвету ,

генциановогоф иолетовогочерез п олоску ф ильтровальнойб у маги. Ч ерез 1- 2 мин. ееснять, акраситель слить.

2.Н анестираствор Л ю голяна1-2 мин.

3.О б есцветить этиловым сп иртом втечение 30-60 сек. до п рекращ ения отхож денияф иолетовыx стру ек красителя.

15

4.Промыть водой.

5.Д окрасить водным раствором ф у ксинавтечение 1-2 мин., п ромыть водой, высу ш ить и микроскоп ировать.

Грамп олож ительные б актерии окраш иваю тся втемно-ф иолетовый цвет, грамотрицательныевкрасный.

О тнош ение б актерий к окраске п о Граму оп ределяется их сп особ ностью у держ ивать об разовавш ийся вп роцессе окраски комп лекс

грамп олож ительных б актерий п еп тидогликан многослоен, с ним связаны

красителяирезистентности к об есцвечиванию сп иртом.

О краскап о Граму имеетваж ноедиф ф еренциально-диагностическое значениеи ш ирокоисп ользу етсявмикроб иологии. К грамп олож ительным

генциановым ф иолетовым и п риоб ретать красный цвет(характерный для грамотрицательных б актерий) врезу льтатеп оследу ю щ ей докраски мазка ф у ксином. Грамотрицательныеб актерии всвою очередь могу тсохранять сине-ф иолетовый цвет генцианового ф иолетового. Д ля п равильной окраски следу етстрогособ лю дать технику об есцвечивания.

О кр а ска кисл о т о уст о йчивы х ба кт ер ийпо мет о д уЦил я - Н ил ьсена

1. Н аф иксированный мазок нанести карб оловый раствор ф у ксиначерез п олоску ф ильтровальнойб у магиип одогреть доп оявленияп ароввтечение

3-5 мин.

2.Снять б у магу , п ромыть мазок водой.

3.Н анести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси сп иртас хлороводороднойкислотой на1 - 2 мин. дляоб есцвечивания.

4.Промыть водой.

5.Д окрасить мазок водным раствором метиленовогосинеговтечение3 - 5 мин.

6.Промыть водой, высу ш ить имикроскоп ировать.

16

К ислотоу стойчивость об у словленаналичием вклеточной стенке и цитоп лазме б актерий п овыш енного количества лип идов, воска и оксикислот, вчастности миколовой кислоты. Раствор карб оловой кислоты разрыхляетклеточну ю стенку и тем самым п овыш аетеетинкториальные свойства, авысокая концентрация красителя и нагревание вп роцессе окраски у силиваю треакцию взаимодействиякрасителяс б актериальными клетками, которыеокраш иваю тсяп ри этом вкрасный цвет. При об раб отке п реп арата серной кислотой некислотоу стойчивые б актерии об есцвечиваю тся и окраш иваю тся метиленовым синим вголу б ой цвет, а кислотоу стойчивыеб актерии остаю тсяокраш енными ф у ксином вкрасный цвет.

Окр а ска зер енво л ют ина по мет о д уН ейссер а

1.Н аф иксированный мазок нанести ацетатсиньки Н ейссерана2 - 3 мин.

2.Д об авить раствор Л ю голяна10 – 30 сек.

3.Промыть п реп аратводой.

4.М азок докрасить водным раствором везу винаили хрезоидинавтечение

0,5 - l мин.

5.Промыть п реп аратводой, высу ш ить имикроскоп ировать.

щелочнойкраситель везу вин и окраш иваетсявж елтый цвет.

Обна р уж ениека псул по мет о д уБ ур р и-Гинса

1.Смеш ать кап лю взвеси микроб ных клеток с кап лей ту ш и и п ри п омощ и стекласош лиф овальным краем сделать мазок таким ж еоб разом, как мазок из крови, высу ш ить и ф иксировать.

2.Н амазок нанести водный раствор ф у ксинана1 - 2 мин.

3.Промыть водой, высу ш ить навозду хе и микроскоп ировать. Бактерии окраш иваю тся в красный цвет, а неокраш енные кап су лы контрастно выделяю тсяначерно-розовом ф оне.

Окр а ска спо р микр о бо в

Плотная об олочкасп ор, неп роницаемая для воды, окраш ивается с б ольш им тру дом, п оэтому п ри об ычных методах окраски сп оры имею твид неокраш енных п у стот вну три клетки. Д ля окраски сп ор п ользу ю тся сп ециальными методами с п рименением п ротрав(кислоты или щ елочи).

красителем, затем об есцвечиваю ткислотойидокраш иваю тдоп олнительно вкакой-ниб у дь контрастный цвет.

17

О кр а ска спо р по мет о д уО ж ешки

1.Н анеф иксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислоты (Н Сl) и п одогреть нап ламени втечение2 - 3 мин.

2.К ислоту слить, п реп аратп ромыть водой, п росу ш ить и ф иксировать над п ламенем. Затем окрасить п ометоду Ц иля-Н ильсена.

Сп оры б актерий п риоб ретаю ткрасный цвет, авегетативныеф ормы – синий.

О кр а ска спо р по мет о д уШ еффер а и Ф ул т о на

1.Н аф иксированный мазок нанести 5 % раствор малахитовогозеленогои

3- 4 разанагреть доп оявленияп аров.

2.Промыть водой.

3.Д окрасить 0,5 % саф ранинавтечение30 сек.

4.Промыть водой.

Сп оры б актерий окраш иваю тсявзеленый цвет, вегетативныеклетки

– вкрасный.

Т ем а 3. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е М Е Т О Д Ы И ССЛ Е Д О В А Н И Я

ПИ Т А Т Е Л ЬН Ы Е СРЕ Д Ы Питательной средой вмикроб иологии называю тсреды, содерж ащ ие

различные соединения слож ного или п ростого состава, которые п рименяю тся для размнож ения б актерий или дру гих микроорганизмовв лаб ораторных илип ромыш ленных у словиях.

Л ю б аяп итательнаясредадолж наотвечать следу ю щ им треб ованиям: содерж ать всенеоб ходимыедляразмнож ениямикроорганизмоввещ ества

среду стерилизу ю топ ределенным сп особ ом взависимости отеесостава. Среды различаю тся:

по ко нсист енции - п лотные, п олу ж идкиеи ж идкие; О сновой п лотной п итательной среды являю тся гелеоб разные

вещ ества: агар-агар (2 - 3%), ж елатин (10 - 15%), которые доб авляю т к

18

по на зна чению – об щ егоназначения(у ниверсальные) и сп ециальные. Ср ед ы о бщ его на зна чения исп ользу ю т для выращ ивания многих п атогенных микроб ови п рименяю твкачествеосновы дляп риготовления

сп ециальных сред, доб авляя к ним кровь, сахара, молоко, сыворотку и дру гиеингредиенты, необ ходимыедляростатогоилииноговидамикроб а.

у словия для выращ ивания одного или нескольких видовмикроб ов. При п осевенаних материала, содерж ащ егосмесь различных микроорганизмов, раньш евсегоб у детп роявлятьсяросттоговида, длякоторогоданнаясреда

бу детэлективной. При создании элективных п итательных средисходятиз

биологических особ енностей, которыеотличаю тданныемикроорганизмы от б ольш инствадру гих. Н ап ример, изб ирательный рост стаф илококков наб лю дается п ри п овыш енной концентрации хлориданатрия, холерного виб рионавщ елочной среде и т. д. И нгиб иторные п итательные среды

активностивследствиенеодинаковогонаб ораф ерментов. Ростб актерийна диф ф еренциально-диагностических средах соп ровож дается изменением цвета колоний, п роисходящ им п од действием ф ерментов микроб ной

содерж ащ иевсвоем составеб елковыевещ ества: кровь, молоко, ж елатин, сверну ту ю кровяну ю сыворотку и т. д.

содерж ащ ие в своем составе химические вещ ества, изменяю щ иеся в окраске б лагодаря окислительному или восстановительному действию

4. Среды с индиф ф ерентными химическими вещ ествами, которыеслу ж ат источником п итаниядляодних видовмикроб ови неу сваиваю тсядру гими видами. Н ап ример, среды с солями лимонной кислоты для выявления разновидности киш ечной п алочки, сп особ ной у сваивать у глерод из молеку ллимонной кислоты.

Д иф ф еренциально-диагностические среды ш ироко исп ользу ю тся в лаб ораторных микроб иологических диагностических исследованиях для диф ф еренциации и идентиф икации б актерий.

у казанну ю наэтикетке(нап ример, 15 г), тщ ательноразмеш иваю твколб ес 1 лдистиллированной воды. К ип ятят1 - 2 мин., недоп у скаяп ригорания, ф ильтру ю тчерез б у маж ный ф ильтр и разливаю твп роб ирки или колб ы.

Стерилизу ю тп ри темп ерату ре120 °Свтечение20 мин.

П ит а т ел ьны й а га р . Состав, г/л: ф ерментативный гидролизат кормовых дрож ж ей - 12,0; агар - 12,5; натрияхлорид - 5,5; рН 7,34. 30 г п орош каразмеш иваю тв1 лдистиллированной воды, кип ятятдоп олного расп лавления агара (2 - 3 мин.), ф ильтру ю т через ватный ф ильтр и

стерилизу ю тп ри темп ерату ре120 °С втечение20 мин. Затем разливаю т п итательный агар в стерильные чаш ки Петри. Д ля п риготовления скош енного п итательного агарап роб ирки с разлитым агаром оставляю т застывать внаклонном п олож ении настоле.

Кр о вяны е, сы во р о т о чны еи а сцит ическиеср ед ы . К расп лавленному

и осту ж енному до45 - 50 °Сп итательному агару асеп тически доб авляю т510 % деф иб ринированной крови или такое ж е количество сыворотки крови, или 25 % асцитической ж идкости, хорош о п еремеш иваю ти сразу ж еразливаю твчаш ки Петри, п роб ирки или дру гу ю лаб ораторну ю п осу ду . Д ля п риготовления ж идкой среды такие ж е количествасыворотки или

теку чим п аром или п аром п оддавлением 0,5 атм.

Эл ект ивны епит а т ел ьны еср ед ы П епт о нна я во д а 1 %, рН 8,0. И зб ирательнадляхолерноговиб риона,

который размнож ается б ыстро, оп ереж ая рост дру гих микроорганизмов. Щ елочная реакция среды не п реп ятству ет росту холерных виб рионов, тормозитростдру гих микроорганизмов.

Щ ел о чно й а га р (п лотная среда): п итательный агар, рН 7,8, аналогичноп редыду щ ейсредеэлективендляхолерноговиб риона.

20

Ср ед а Л еффл ер а . Смесь 1 части лош адиной сыворотки и 3 частей сахарного б у льона. Среда элективна для коринеб актерий диф терии. Быстрый ростэтих микроорганизмов(4 - 6 ч) об есп ечиваетэлективность

размнож ению стаф илококков, что об есп ечиваетэлективность этой среды для данных микроорганизмов. В качестве основы исп ользу ю т солевой агар. По п роп иси, у казанной наэтикетке, готовят1,8 - 2 % агар, рН 7,2 -

лецитиназоп олож ительных видов(ф ерментрасщ еп ляетлецитин ку риного ж елтка).

Свеж еп риготовленнаясредаб есцветнаилиимеетб ледно-розову ю окраску . При росте лактозоп олож ительных б актерий их колонии окраш иваю тся в

микроорганизмов(киш ечнаяп алочкаи др.) и сп особ ству етлу чш ему росту некоторых п атогенных б актерий (возб у дители б рю ш ноготиф а, п аратиф ов, дизентерий). Л актозоотрицательные б актерии об разу ю т на этой среде б есцветныеколонии, алактозоп олож ительныекрасные.

Висмут -сул ьфит а га р . Среда п редназначена для выделения сальмонеллиз инф ицированного материала. В ып у скается всу хом виде; содерж иттрип тический гидролизаткильки, глю козу , неорганическиесоли, б риллиантовый зеленый, агар. Д иф ф еренциру ю щ ие свойства среды