2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Санитарно_бактериологический_контроль_и_микробиологические_методы

21

основаны насп особ ности микроорганизмовп роду цировать Н 2S, который

б раку ю тся и отп равляю тся вмойку , аостальные б еру тся враб оту или оставляю тсянахранение. Н екоторыеп итательныесреды мож ноготовить вп рок на2 - 3 недели. Создавать зап асы наб олееп родолж ительноевремя нецелесооб разно, так как врезу льтатедолгогохранениясреды высыхаю ти изменяю тсвойства.

Х ранить п итательные среды лу чш е всего вхолодильниках, однако хранениеих возмож нои п ри комнатнойтемп ерату ревш каф ах с секциями. В каж доеотделение со средой вкладываю тоб язательно листок б у маги с названием п итательной среды и даты ее п риготовления. Помещ ение, в котором хранятсясреды, долж ноб ыть п рохладное, защ ищ енноеотсвета, су хое. Поверх п роб ок наф лаконы и колб ы надеваю тб у маж ныеколп ачки

металлическиеили стеклянныеш п атели. Д ляп осевовж идких материалов наряду с п етлей исп ользу ю тп астеровски и граду ированныеп ип етки.

По сев в ча шки П ет р и с пл о т но йпит а т ел ьно йср ед о й

По сев пет л ей: п осевной материал втираю т п етлей вп оверхность

среды у края чаш ки, изб ыток снимаю т, п роколов п етлей агар, а оставш ийсяматериалрассеиваю тп араллельнымиш трихамип остерильной п оверхностисреды. Э тонаиб олеерасп ространенный сп особ п осева.

П о сев шпа т ел ем: материалнаносят нап оверхность среды п етлей или п ип еткой, а затем стеклянным или металлическим ш п ателем тщ ательновтираю тегоп овсей п оверхности агара. При этом левой ру кой п ридерж иваю г слегка п риоткрыту ю крыш ку и одновременно вращ аю т чаш ку . После п осеваметаллический ш п атель п рокаливаю т вп ламени горелки, астеклянный п омещ аю твдезинф ициру ю щ ий раствор.

22

По сев т а мпо но м: тамп он с исследу емым материалом вносятвчаш ку

икру говыми движ ениями втираю тего содерж имоевп оверхность среды, одновременновращ аятамп они чаш ку .

П о сев на сект о р ы : дно чаш ки расчерчиваю т на секторы, п осев п роизводят зигзагооб разными движ ениями от края чаш ки к центру так, чтоб ы ш трихи с одногонеп ереходили надру гой.

П о сев га зо но м: 1 мл исследу емого материала(ж идкая б у льонная ку льту ра или взвесь микроб ов в ф изиологическом растворе) наносят п ип еткой нап оверхность среды и тщ ательно расп ределяю тж идкость п о всей ееп оверхности. И зб ыток материалаотсасываю тп ип еткой и вместес ней п омещ аю т в дезинф ициру ю щ ий раствор. После п осева чаш ки закрываю ти п ереворачиваю тих вверх дном. Н адп иси начаш ках делаю тсо стороны дна, анап роб ирках - вверхней части.

П о сев иссл ед уемо го ма т ер иа л а в т о л щ у пл о т но й пит а т ел ьно й ср ед ы . М атериал, засеваемый втолщ у п итательной среды, долж ен б ыть в ж идком состоянии. Д ляэтогоиз материала, п одлеж ащ егоп осеву , готовят взвесь (в стерильной водоп роводной воде или в ф изиологическом растворе), наб ираю теевп ип етку воб ъ еме0,1; 0,5 или 1 млвзависимости от п редп олагаемого микроб ного загрязнения и выливаю т в п у сту ю стерильну ю чаш ку Петри. В следзаэтим чаш ки заливаю т15 - 20 млМ ПА ,

расп лавленным и осту ж енным до40 – 45 °С (п ри такой темп ерату ре, если п рилож ить п роб ирку сосредой к щ еке, онанедолж навызывать ощ у щ ения ож ога). Д ля равномерного расп ределения исследу емого материала в п итательной средечаш ку с содерж имым б еру твру ки и слегкап окачиваю т вразныестороны.

П о сев на пл о т ны еи ж ид киепит а т ел ьны йср ед ы в пр о бир ка х

При п осеве иноку лятаиз п роб ирки вп роб ирку об е п роб ирки (с п осевным материалом и со средой) держ атслегканаклонно влевой ру ке меж ду б ольш им и у казателыным п альцами так, чтоб ы краяп роб ирок б ыли

вынимаю тп равой ру кой, заж имаяих меж ду мизинцем и ладонью . В ыну в п роб ки, краяп роб ирок об ж игаю твп ламени горелок. Прокаленну ю п етлю вводят через п ламя горелки в п роб ирку с п осевным материалом, охлаж даю т и неб ольш ое количество п осевного материала осторож но п ереносятвп роб ирку сосредой.

1. При п осевенаж идку ю среду п етлю слегкап огру ж аю твж идкость и растираю тп осевной материалнастенкеп роб ирки, п ослечегосмываю т его средой. Д ля п осева ж идкого материала мож но исп ользовать

ш трихооб разными движ ениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды, аесли агар или ж елатин разлит вп роб ирки столб иком, то п осев п роизводяту колом, п рокалываяп етлейсп осевным материалом столб ик до

23

дна. После п осевап етлю извлекаю т из п роб ирки, п роб ирку закрываю т, п редварительноп роведяеекраячерез п ламягорелки. Петлю п рокаливаю т.

Посевы инку б иру ю тсявтермостатеп ри 37 °Свтечение18 - 24 ч. За это время из отдельных микроб ных клеток ф ормиру ю тся изолированные колонии.

слу ж итьколония, состоящ аяиз микроб ных клеток одногоитогож евида. Полу чение чистых ку льту р необ ходимо для изу чения морф ологических, ку льту ральных и б иологических свойстввыделенного микроорганизмав целях оп ределения его видовой п ринадлеж ности. Д лявыделения чистых ку льту р п ользу ю тся методом рассевав глу б ине п итательной среды и методом п осеванап оверхность п итательнойсреды (методД ригальского).

исследу емый материал. Затем п ип еткой или п етлей содерж имоеиз п ервой

ладонями, вращ аю т несколько раз водну и затем вдру гу ю сторону . Приготовленныетаким об разом разведениямикроорганизмоввыливаю тиз п роб ирок вчаш ки Петри, об означенные номерами, соответству ю щ ими номерам п роб ирок. Послезасту дневаниясреды сисследу емым материалом

разливаю тв3 чаш ки Петри. Застывш у ю среду об язательноп одсу ш иваю т.

п рож игаяиненаб ираяновогоматериала, ш п атель п ереносятвовтору ю и в третью чаш ки, втираявп оверхность п итательных средоставш ийсянанем материал.

М етод рассева п о п оверхности, п редлож енный Д ригальским, является наиб олее у п отреб ительным для п олу чения чистой ку льту ры микроорганизмов. В местош п ателямож ноп ользоватьсяп етлей. М атериал

24

нап итательной средерасп ределяю тгу стыми п араллельными ш трихами п о

всей чаш кеводном нап равлении. Затем, п оверну вчаш ку на180°, той ж е п етлей п роводят ш трихи в нап равлении, п ерп ендику лярном п ервым ш трихам. В резу льтатенап оверхности п итательной среды вычерчивается гу стаясетка. При таком сп особ еп осеваматериал, содерж ащ ийсянап етле, расходу етсяп остеп енно, и п о линиям сетки, нанесенным вконцеп осева, вырастаю тизолированныеколонии микроб ов.

В ыделение чистой ку льту ры методом рассева в глу б ине и на п оверхности п итательной среды основанонамеханическом разъ единении

К оличество микроорганизмов, содерж ащ ееся висследу емом материале, п реду гадать заранее тру дно, п оэтому для п осевап ользу ю тся не одной, а

настолько гу стым, что п олу чить материал из отдельной колонии для выделения чистой ку льту ры невозмож но. Т огда для выб ора изолированных колоний п ользу ю тся второй чаш кой. Е сли ж е и наней колонии расп олож ены б лизко дру г к дру гу , б еру т чаш ку с третьим разведением.

Д лявыделениячистой ку льту ры п атогенных микроорганизмовчасто п ользу ю тся п осевом исследу емого материала на элективные и ингиб иторныеп итательныесреды.

За д а ниед л я вы по л нения л а бо р а т о р но йр а бо т ы

1.Рассмотреть нараздаточном материалехарактер ростаразличных

бактериальных ку льту р на п лотных и ж идких п итательных средах,

п у тем изу ченияморф ологии б актерий, их ку льту ральных, б иохимических и дру гих п ризнаков, п рису щ их каж дому виду .

Кул ьт ур а л ьны епр изна ки. К у льту ральные свойствахарактерны для

ку льту ры необ ходимо у читывать и отмечать вп ротоколе исследования. В озраст ку льту ры, наиб олее б лагоп риятный для изу чения ее свойств, зависит от видовой п ринадлеж ности микроорганизма, так как для п оявления выраж енных п ризнаков роста различным микроорганизмам необ ходиморазноевремя. Н ап ример, колонии чу мной п алочки могу тб ыть

25

об нару ж ены и п одвергну ты изу чению через 10 - 12 часов, колонии б актерий ту б ерку лезатолькочерез нескольконедель отмоментап осева.

К данным п ризнакам относятся морф ологические особ енности колоний б актерий, характер ростанап лотных и вж идких п итательных

могу тб ыть кру п ные(диаметр б олее4 - 5 мм), средние(2 - 4 мм) ималые(1 - 2 мм), п о ф ормекру глые, розеткооб разные, листовидныеи т. д. Ц вет колонии зависитотвыраб отки оп ределенногоп игмента- б елого, ж елтого,

исчерченной, п лоской, вып у клой, вдавленной. К рай колонии мож етб ыть

характеризу ю тсяп ридонным, п ристеночным ростом; некоторыеку льту ры об разу ю тп ленки нап оверхности среды, дру гиеосадок наднеп роб ирки.

микроб овф ерменты играю тб ольш у ю роль. О ни являю тсяоб язательными у частниками разнооб разных б иохимических реакций, леж ащ их воснове ф у нкций п итания, дыхания. К аж дый вид микроорганизмовп роду циру ет п остоянный длянегоп околичеству и качеству наб ор ф ерментов. Поэтому

п роду ктами их расщ еп ленияявляю тсягазооб разныевещ ества: СО 2 и Н 2.

ку льту ру б актерий засеваю т в п итательные среды Гисса, называемые

К ороткий «п естрый» рядГиссасодерж итоб ычно5 п роб ирок: с глю козой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для б олееу глу б ленного изу чения б иохимических свойств выделенногомикроорганизмаисп ользу ю тдлинный«п естрый» рядГисса, в составкоторого наряду с п еречисленными у глеводами входят и дру гие «сахара»: ду льцит, сорб ит, ксилоза, араб иноза, крахмал, ину лин, гликоген и др.

Н азвание «п естрый» ряд об у словлено тем, что п од действием ф ерментоврасту щ его микроб аодни у глеводы остаю тся неизменными и, следовательно, цвет п итательной среды не изменяется, вто время как дру гиесахарарасщ еп ляю тся, об разу якислыеп роду кты расп ада, которые изменяю тцветиндикатораи соответственноцветп итательнойсреды.

п роду ктами расп адасахаров, оп у скаю т«п оп лавок» , который п редставляет

газооб разных п роду ктовп оследние вытесняю т часть находящ ейся внем ж идкости, вследствие чего у зап аянной верху ш ки п оп лавкаоб разу ется возду ш ный п у зырек различной величины. В п олу ж идких средах Гисса газооб разованиеоп ределяю тп оналичию мелких п у зырьковвтолщ есреды

Н а1-й п роб иркекаж дого ряда, кроменазвания сахара, у казываю тномер

методике. При п ереносе п етли из п роб ирки с одной сахарной средой в дру гу ю п етлю об язательно п рож игаю т, а исп ыту ему ю ку льту ру б еру т заново. Ш тативс засеянными средами Гиссаставятвтермостатп ри37 или

43 °С взависимости от исследу емого материалаи цели исследования. После инку б ации в термостате у читываю т резу льтаты ф ерментации сахаров.

И зменениецветап итательной среды вп роб иркеоб означаю тб у квой К , что соответству ет об разованию в среде кислых п роду ктоврасп ада сахара. К ислотооб разование, соп ровож даю щ ееся п оявлением п у зырьков газавп оп лавкеили втолщ еп олу ж идкой среды, об означаю твп ротоколе

химическая п рирода которых изу чена недостаточно. Под действием п еп толитических ф ерментовп еп тоны всвою очередь расщ еп ляю тся на п олип еп тиды (соединениядву х или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты.

Д лявыявленияп ротеолитических ф ерментовисследу ему ю ку льту ру засеваю т вп итательну ю среду , содерж ащ у ю тот или иной б елок. Ч ащ е всего для этой цели п рименяю т ж елатин, реж е - сверну ту ю лош адину ю сыворотку , коагу лированный яичный б елок, молокоили ку сочки вареного мяса.

Протеолитическая активность одного и того ж е микроб а п ри оп ределении ее на различных п итательных средах б у дет п роявляться неодинаково, что об у словливается сп ециф ичностью ф ерментов. Поэтому дляразных видовмикроб оврекоменду ю тп итательныесреды различного состава.

2.1. О пр ед ел ениепр о т ео л ит ическо й а кт ивно ст и микр о бо в на ж ел а т ине.

М ясо-п еп тонный ж елатин разливаю твп роб ирки столб иком п о 5 - 6 мл.

низкойтемп ерату ре, оставляю тстоять вкомнатеп ри20 - 22 °С. О стальные

п осевы инку б иру ю т в термостате п ри 37 °С. В месте с оп ытными п роб ирками втермостат ставят одну или две п роб ирки с незасеянным

ж елатином для контроля. При темп ерату ре 37 °С ж елатин п лавится, п оэтому п ослеинку б ации п роб ирки, выну тыеиз термостата, оп у скаю тна

среды. Проб ирки, в которых п осле су точного инку б ирования среда

у читываю тинтенсивность ростаи ф орму разж иж енияж елатиновой среды. Разж иж ениеж елатинау разных видовмикроб овп роисходитнеодинаково. Т ак, нап ример, различаю тп ослойноеразж иж ениеж елатина, п ри котором п оследовательно разж иж ается один горизонтальный слой задру гим в нап равлении сверху вниз. У некоторых видов б актерий отмечаю т

28

разж иж ениекратерооб разноес вогну тостью п оверхности вф ормечайного

п ротеолитической активностью об ладаю тсп особ ностью расщ еп лять б елок и п еп тон до п роду ктов глу б окого расп ада: индола, сероводорода,

об разу ется из слож ной гетероциклической аминокислоты - трип тоф ана. Сероводород является конечным п роду ктом расщ еп ления аминокислот: цистина, цистеинаи метионина, содерж ащ их всвоем составесеру .

2.2. О пр ед ел ение инд о л а в кул ьт ур е (П о М о р ел ю). Д ля выявления индолооб разования засеваю т п етлю исследу емой ку льту ры микроб а в М ПБ, п риготовленный на п ереваре Х оттингера, содерж ащ ем б ольш ое количество своб одного трип тоф ана. Т отчас ж е п осле п осева п олоску индикаторной б у маги, п роп итанну ю раствором щ авелевой кислоты, оп у скаю твп роб ирку так, чтоб ы онанеу п алавп итательну ю среду и не

(сп иртовой раствор п арадиметиламидоб ензальдегидас хлороводородной кислотой). О п ределение п роводят следу ю щ им об разом: в п роб ирку с ку льту рой б актерий п риб авляю т 2 - 3 млэф ира, содерж имое энергично п еремеш иваю т и доб авляю т несколько кап ель реактива Э рлиха. О краш иваниеэф ирного слоявмалиново-красный цветсвидетельству ето п олож ительнойреакции наиндол.

2.3. О пр ед ел ение сер о во д о р о д а . Петлю исследу емой ку льту ры микроб ов

слу чаях об разу ю щ ийся вку льту ре сероводород всту п ает всоединение с б есцветным у ксу снокислым свинцом, п ревращ аясь всернокислый свинец, который п ридает индикаторной б у маге черно-б у рое окраш ивание. О б разованиесероводородаииндолавку льту реоп ределяю тодновременно. С этой целью вп роб ирку с засеянным б у льоном вносятодновременнодве индикаторные б у маги: на индол и сероводород. Д ля того чтоб ы индикаторныеб у маги неу п али вп итательну ю среду и некасались б ы ее

об разование индолаи сероводородап роизводят на7 - 10-й день п осле

29

п роизведенного п осева, так как п роцесс ф ерментативного расщ еп ления б елкаи об разования конечных п роду ктоврасп адап роисходит иногдав

восстановительныеф ерменты, связанныеглавным об разом с дыхательной

др. Д лявыявленияреду циру ю щ их свойствмикроб ау казанныекрасители доб авляю тк об ычным п итательным средам: М ПБ, М ПА , молоку .

О дин и тотж евидмикроб аведетсеб янеодинаковоп оотнош ению к краскам разного состава. Э то свойство микроб а исп ользовано в микроб иологической п рактике вкачестве диф ф еренциального п ризнака. Бактерии б рю ш ного тиф а реду циру ю т метиленову ю синь, но не реду циру ю т лакму саи не изменяю т нейтральрот вп ротивоп олож ность

п ринадлеж ащ иек гру п п еаэроб ов, вп роцесседыханияоб разу ю тп ерекись водорода, являю щ у ю сяклеточным ядом. К оличествоп ерекиси водородав ку льту ре никогдане достигает высоких концентраций, так как п о мере об разованияп ерекись разлагаетсянаводу и молеку лярный кислород п ри

диф ф еренциации разновидностей п атогенных микроб ов, выделенных из организмаб ольного и об ъ ектоввнеш ней среды. Н ап редметное стекло наносяткап лю 1 - 3 % растворап ероксидаводородаивносятвнееп етлю с б актериальной ку льту рой. К аталаза разлагает п ероксид водорода на

кислород и воду . В ыделение п у зырьковО 2 свидетельству ето наличии у данноговидаб актерий ф ерментакаталазы.

В б актериологической п рактике иногдаограничиваю тся изу чением сахаролитических и п ротеолитических п ризнаковисследу емых б актерий, если это является достаточным для их идентиф икации. В необ ходимых слу чаях п роводят изу чение дру гих п ризнаков, нап ример сп особ ности к восстановлению нитратов, карб оксилированию аминокислот, об разованию оксидазы, п лазмокоагу лазы, ф иб ринолизинаи дру гих ф ерментов, атакж е

30

оп ределение антигенной стру кту ры, чу вствительности к ф агам, виру лентности ит. д.

В се этап ы выделения и идентиф икации чистой ку льту ры б актерии мож ноп редставить ввидесхемы:

Iэт а п Иссл ед уемы йма т ер иа л

1.М икроскоп иямазковили нативных п реп аратов.

2.Посевначаш ки Петри с п итательным агаром.

3.Посевнаэлективну ю среду .

4.Посевнадиф ф еренциально-диагностическу ю среду .

IIэт а п Х а р а кт ер ист ика изо л ир о ва нны х ко л о ний

1.М азок-окраскап оГраму илидру гим методом

дляизу ченияморф ологии клеток

иих тинкториальных свойств.

2.Посевнаскош енный п итательный агар илидру гиесреды длянакоп лениячистой ку льту ры.

IIIэт а п Х а р а кт ер ист ика р о ст а кул ьт ур ы

1.М азок-окраскап оГраму илидру гими методами дляп роверки однородности ку льту ры.

2.Пересевнасреды «п естрого» ряда длявыявленияб иохимических п ризнаков.

3.Серологическиереакции дляизу чения антигенных свойств.

4.Зараж ениеи вскрытиелаб ораторных ж ивотных дляоп ределениявиру лентности.

об раб откекислотой – длявыделениякислотоу стойчивых б актерий и т.п . 2. У словияинку б ации п осевовзависятотф изиологических особ енностей

б актериальной ку льту ры, п оэтому аэроб ные б актерии выращ иваю т в п рису тствии кислородавозду ха, анаэроб ные б актерии – б ескислородной среде: некоторые б актерии лу чш е расту т п ри п овыш енном содерж ании

СО 2.