4 курс / Неврология, мед.ген. / Медицинская генетика / Med_genetika_N_P_Bochkov_A_Yu_Asanov_N_A_Zhuchenko_T_I_Subbotina
.pdf7.Ушные раковины: микротия, макротия, деформированные, низкопосаженные, отклоненные назад, оттопыренные, завитки со сглаженным упрощенным рисунком, предушные фистулы, предушные папилломы.
8.Область глаз и глаза: эпикант, страбизм (косоглазие), монголоидный разрез, антимонголоидный разрез, гипертелоризм, гипоте-лоризм, телекант, колобома радужки, двойной или тройной ряд ресниц, миопия, гиперметропия, птоз, блефарофимоз, короткая глазная щель, гетерохромия
радужек, синофриз, микрофтальм, экзофтальм, голубые склеры.
9.Лицо: плоское, круглое, треугольное, вытянутое, с грубыми чертами.
10.Нос: седловидная переносица, широкая плоская переносица, короткий нос, открытые вперед ноздри, плоские крылья носа, клювовидный нос.
11.Губы и рот: фильтр (длинный, короткий, плоский, глубокий), губы (тонкие, толстые); макростомия, микростомия, короткая уздечка языка, множественные уздечки губ, микроглоссия, мак-роглоссия.
12.Челюсти: прогения, ретрогения, микро- и макрогения, микро- и макрогнатия, диастема (верхняя, нижняя).
13.Зубы: гипоплазия эмали, неправильная форма, неправильное расположение, врожденный избыток зубов, врожденное отсутствие одного или нескольких зубов.
14.Небо: плоское, высокое, арковидное, готическое; расщепление язычка.
15.Шея: короткая и длинная, кривошея, низкая линия роста волос, крыловидные складки.
16.Грудная клетка и позвоночник: долихостеномелия, воронкообразная, килевидная, дополнительные соски, гипертелоризм сосков, сколиоз, кифоз, лордоз, пиломидальная ямка.
17.Конечности и сустав: укороченные или удлиненные, Х- или О-образные, переразгибание суставов, полидактилия, олигодак-тилия, брахидактилия, арахнодактилия, клинодактилия, камп-
тодактилия, синдактилия, широкий первый палец, гипоплазия первого пальца, укорочение отдельных пальцев, поперечная ладонная складка, одна складка на пятом пальце, плоскостопие, косолапость, полая стопа, конская стопа.
18. Мочеполовая система: крипторхизм, гипоспадия, шалевидная мошонка, увеличенный клитор.
7.2. ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Лабораторная диагностика наследственных болезней развивалась параллельно с пониманием генетической этиологии болезней и их патогенеза. Так, например, биохимическая диагностика алкаптонурии была осуществлена 100 лет назад; в 30-х годах ХХ века была открыта простая реакция для диагностики фенилкетонурии (зеленая окраска в реакции мочи с хлоридом железа).
Широкое применение лабораторных методов диагностики наследственных болезней началось в 50- х годах, и их арсенал быстро пополнялся. В практику входили многочисленные методы лабораторных исследований: биохимический, иммунологический, цитологический, гематологический, цитогенетический, молекулярно-биологический. Это способствовало прогрессу клинической генетики, что в свою очередь стимулировало развитие лабораторно-генетических методов.
Лабораторная диагностика наследственных болезней может быть направлена на идентификацию одной из трех «ступеней»: этиологии, первичного звена патогенеза, вторичных изменений патогенеза.
Первая ступень - этиология болезни, т.е. характеристика генотипа, а точнее - выявление конкретной мутации у обследуемого индивида. Это могут быть генные, хромосомные или геномные мутации. Генные мутации выявляются молекулярно-биологическими методами, хромосомные и геномные - цитогенетическими.
Вторая ступень - выявление первичного продукта патологического гена, т.е. первой ступени патогенеза. Для его регистрации применяют точные биохимические, иммунологические или иммуноферментные методы.
Третья ступень - регистрация специфических метаболитов измененного обмена, возникающих в процессе реализации мутантного первичного продукта или его отсутствия. Эта ступень выполняется на уровне клеток или жидкостей (кровь, секрет, моча) с использованием биохимических, иммунологических, цитологических методов.
В данной главе будут рассмотрены только принципы трех специфически генетических лабораторных методов. Они входят в арсенал методик всех медико-генетических консультаций и проводятся врачом-лаборантом вместе с фельдшером-лаборантом. Наибольшее место в диагностической практике занимают цитогенетические и биохимические методы, реже - молекулярно-генетические.
7.2.1. Цитогенетические методы
Изучение строения и функции хромосом привело к выделению самостоятельного раздела области науки - цитогенетики. Началом развития цитогенетики человека можно считать 50-60 годы, когда впервые появились публикации работ, в которых удалось получить убедительные картины морфологии всех Х-хромосом человека и правильно определить их диплоидное число.
Суть цитогенетических методов, при всем разнообразии отдельных этапов, заключается в микроскопическом анализе хромосом, позволяющем выявить числовые и структурные изменения хромосомного набора (кариотипа), так называемые хромосомные и геномные мутации. В 50-х гг. нашего столетия использование цитогенетических методов послужило толчком к открытию этиологии нового класса заболеваний у человека - хромосомных болезней. В 1959 г. впервые появились сообщения о специфических изменениях числа хромосом при синдроме Дауна (добавочная 21-я хромосома), аномалиях в системе половых Х-хромосом. Далее, в течение достаточно короткого периода времени описаны и другие хромосомные болезни. Цитогенетические методы стали широко входить в медицину. Было выявлено, что множественные пороки развития у новорожденных часто обусловлены нарушением хромосом. Значительная часть хромосомных и геномных мутаций выявлена у мертворожденных и спонтанно абортированных эмбрионов. Стала развиваться и цитогенетика злокачественных опухолей человека. Таким образом, в настоящее время цитогенетика прочно вошла в клиническую медицину.
Методы цитогенетического исследования можно условно подразделить на прямые и непрямые. Прямые методы - это методы получения препаратов делящихся клеток без культивирования. Непрямые методы - это получение препаратов хромосом из клеток, культивированных в искусственных питательных средах. При обоих методах объектом цитогенетического исследования являются хромосомы в стадии метафазы митоза, поскольку, как уже говорилось выше, именно на этой стадии возможна точная идентификация хромосом и выявление их нарушений. Исследование хромосом в мейозе также возможно, однако у человека это связано с методическими трудностями в получении биоптатов из половых желез.
Прямые методы позволяют проводить хромосомный анализ клеток опухолей, но в основном используются для изучения костного мозга. Костный мозг получают при стернальной пункции, помещают его в питательную среду, добавляют колхицин (он останавливает деление клеток на стадии метафазы митоза), инкубируют клетки около 2-3 часов при 37 °С, а затем готовят препараты хромосом.
Непрямые методы связаны с культивированием клеток. Наиболее простым и доступным методом в клинической цитогенетике является анализ хромосом лимфоцитов периферической крови человека на стадии метафазы. Для этого используется цельная периферическая кровь, полученная при соблюдении стерильных условий, в количестве 1,0 мл. Кровь помещают в питательную среду с добавлением митогена ФГА (фитогемагглютинина), стимулирующего митотическое деление лимфоцитов. Далее культура помещается в термостат и при 37 °С культивируется 48-72 часа. За 2
часа до окончания культивирования вводится колхицин. Приготовление препаратов хромосом проводится по общепринятым методам, описанным в соответствующих лабораторных справочниках.
Препараты хромосом можно получать и из других клеток и тканей, используя различные модификации описанного метода культивирования лимфоцитов. Так, в пренатальной диагностике наиболее часто используют получение хромосом из клеток ворсин хориона, плаценты, пуповинной крови и амниотической жидкости, эмбриональных органов. Разработаны различные варианты приготовления препаратов хромосом путем «прямых» методов, краткосрочной культивации, культивирования в течение 2-3 суток и, наконец, длительного культивирования в течение нескольких недель.
Очень важным моментом для анализа хромосом является их окрашивание. Сплошное или равномерное окрашивание хромосом получило название рутинной окраски. Для рутинной окраски используют простые красители: азур-эозин или краситель Гимза. Пример метафазной пластинки, окрашенной красителем Гимза, представлен на рисунке (рис. 7.1).
Рис. 7.1. Метафазная пластинка; окрашивание хромосом красителем Гимза
Использование такого метода окрашивания позволяет провести подсчет хромосом и их групповую принадлежность, проанализировать повреждения хромосом, называемые хромосомными аберрациями (рис. 7.2). Однако этот метод имеет ограничения при кариотипировании, поскольку не дает возможности индивидуальной идентификации хромосом. Методы окраски хромосом, дающие достаточно полное представление о кариотипе, появились в 70-х гг. нашего столетия - это методы дифференциального окрашивания хромосом. Большое практическое значение этих методов состоит в том, что дифференциальная окраска позволяет идентифицировать все хромосомы человека, благодаря специфическому линейному рисунку - продольной окрашиваемости для
каждой хромосомы в соответствии с типом окраски. На практике наибольшее применение получили методы дифференциальной окраски красителем Гимза (G-окраска) и флюоресцирующим красителем акрихином или акрихин-пиритом (Q-окраска) (рис. 7.3).
Для каждого из видов окраски разработаны многочисленные модификации технического выполнения этапов, в этих случаях применяется трехбуквенная система обозначения вида окраски. Например, G-метод с применением трипсина (GTG); Q-метод с использованием акрихина и его производных (QFQ) и т.д.
Методы дифференциального окрашивания пригодны для анализа хромосом, полученных из культур клеток любых тканей.
Цитогенетические методы сразу же нашли практическое применение в диагностике хромосомных болезней. Клиническая картина при хромосомных синдромах достаточно специфична, но есть и стертые формы, трудные для клинической диагностики. Их невозможно клинически дифференцировать. В этих ситуациях определяющей является цитогенетическая диагностика. Так, например, на консультацию по поводу бесплодия обратились супруги (23-24 лет), живущие в браке 3 года. Жена в течение 3 лет наблюдалась в женской консультации по поводу бесплодия и получала все это время достаточно интенсивную терапию. При этом муж не был обследован. При осмотре мужа врачом-генетиком был заподозрен синдром Клайнфельтера (высокий рост, скудное оволосение по женскому типу, избыточное развитие молочных желез, недоразвитие одного яичка). При цитогенетическом исследовании кариотипа подтвержден диагноз синдрома Клайфельтера. Его хромосомный набор - 47,XXY. Эта хромосомная патология и явилась причиной бесплодия.
Рис. 7.2. Метафазная пластинка с хромосомными абберациями (указаны стрелочками)
В середине 70-х гг. исследования цитогенетиков показали, что большинство крупных и малых сегментов метафазных хромосом образуются путем слияния субсегментов, которые более четко видны на ранних стадиях митоза - профазы и прометафазы. На этих стадиях хромосомы менее конденсированы, недоспирализованы и поэтому имеют большую линейную подразделенность. Далее были разработаны различные методы получения делящихся клеток на стадии прометафазы.
Рис. 7.3. Метафазная пластинка с дифференциальной окраской хромосом (46,XY) акрихин-ипритом
Таким образом, метод анализа хромосом на стадиях профазы и прометафазы дал возможность более точно устанавливать точки разрывов в перестроенных хромосомах, если в перестройку вовлечены небольшие участки хромосом. Такие аномалии называют микроперестройками.
Использование этого методического подхода позволило получить хромосомы с разной степенью
сегментации -от 550 до 2500 сегментов на гаплоидный набор (для сравнения в метафазных хромосомах средней конденсации число сегментов на гаплоидный набор составляет 350-400).
С точки зрения практического использования анализа прометафазных хромосом, этот метод целесообразно применять для диагностики болезней с микроперестройками в структуре одной или нескольких хромосом (транслокации, делеции, инверсии) для уточнения локализации точек разрывов хромосом.
Иногда аномальные хромосомы, претерпевшие транслокацию, появляются в результате разрывов двух различных хромосом и их последующего аберрантного объединения. Транслокация может происходить de novo в половых клетках одного из родителей, но может и представлять собой наследование мутации, произошедшее у одного из предков. Носители транслокаций клинически здоровы. Эти и другие структурные перестройки хромосом часто являются причиной спонтанных абортов, мертворождений, неонатальной смертности и бесплодия.
Например, в консультацию обратилась супружеская пара по поводу привычного невынашивания беременности. Из анамнеза: пять самопроизвольных выкидышей на сроке до 8 недель, клиническое обследование супругов не выявило особенностей. При цитогенетическом обследовании выявлено, что кариотип мужа нормальный (46, XY), а у жены - 45,XX,t(13;14), т.е. выявлена транслокация. При такой транслокации нет изменений у носительницы, но в мейозе у нее образуются аномальные гаметы.
Некоторые микроструктурные перестройки хромосом выявляют при множественных врожденных пороках развития, при различных злокачественных новообразованиях до развития клинических проявлений. Так, показано, что в ряде случаев в клетках ретинобластомы, остеосаркомы, феохромоцитомы, имеются хромосомные перестройки (делеции хромосом).
Однако при некоторых нозологических формах даже использование таких высокоразрешающих методов хромосомного анализа не приводит к обнаружению хромосомных повреждений. Это может свидетельствовать о генетической гетерогенности самих заболеваний, а также, возможно, и о пределе разрешающих возможностей описанного метода.
Относительно недавно в арсенале лабораторной цитогенетики появились высокоразрешающие методы - молекулярно-цитогенетический метод гибридизации in situ, в частности флуоресцентная гибридизация in situ, или FISH-метод.
Метод гибридизации in situ основан на обработке препаратов хромосом специфическим ДНКзондом, который присоединяется к исследуемой хромосоме, и после обработки специальными соединениями и флуоресцентными красителями препарат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа. Для сравнения разрешающих способностей метода приведем следующие сведения. При рутинной окраске хромосом самый маленький нарушенный участок хромосомы в виде делеции или дупликации, который можно различить под обычным световым микроскопом, содержит 30 х 106 нуклеотидов. Применение дифференциальных методов окраски увеличивает такую возможность до (7-10) х 106нуклеотидов. При анализе хромосом на стадии ранней метафазы или профазы различимы микроперестройки размером (1-3) х 106 нуклеотидов. А вот следующий уровень разрешения уже обеспечивается только молекулярно-цитогенетическим методом. Такая высокая разрешающая способность метода позволяет применять непосредственно FISH-метод или его варианты в достаточно широких пределах: от определения локализации гена до расшифровки сложных перестроек хромосом. Как пример практических возможностей метода можно привести следующее.
У ребенка с множественными врожденными аномалиями при использовании метода дифференциального окрашивания обнаружены сложные перестройки в шести хромосомах (1, 4, 7, 8, 9, 12) с десятью разрывами. Полная идентификация разрывов стала возможной только с помощью FISH-метода. Этот же метод можно применять для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах. Например, специфический для 21-й хромосомы зонд ДНК гибридизируется с денатурированной ДНК в клетках из амниотической жидкости на предметном стекле. Если у плода
две 21-Х-хромосомы (норма), то везде будут видны 2 флюоресцирующие соответствующим цветом точки. При наличии у плода трисомии-21 в ядре визуализируются три светящиеся точки.
Как и для других цитогенетических методов, в зависимости от цели исследования, используются различные варианты FISH-метода. Так, в онкоцитогенетике достаточно сложно получить хромосомы хорошего качества, поэтому используется метод сравнительной геномной гибридизации, основанный на гибридизации ДНК пациента с контрольными препаратами хромосом. При таком подходе можно выявить участки ДНК с делециями (потерями) и дупликациями (удвоениями). Метод применяют и для составления карт генов, вовлеченных в опухолевый процесс.
Таким образом, цитогенетические методы стали практически незаменимыми процедурами в разных областях науки и клинической практики. Кроме диагностики заболеваний, цитогенетические методы широко используются в профилактической медицине. Уже давно показано повышение уровня хромосомных повреждений (аберраций) у курильщиков, у лиц, подвергшихся действию ионизирующей радиации, при воздействии на организм человека вредных химических факторов производства и окружающей среды, употреблении ряда лекарственных препаратов. В определенной степени типы хромосомных аберраций специфичны для разных групп мутагенных факторов. Так, при воздействии химических мутагенов чаще возникают аберрации хроматидного типа (повреждена одна хроматида; рис. 7.4), а при воздействии ионизирующего излучения - хромосомного типа (рис. 7.5).
Рис 7.4. Метафазная пластинка. Стрелкой указан одиночный фрагмент (абберация хроматидного типа)
Изучены количественные закономерности спонтанного и индуцированного мутагенеза. На этой основе разработаны системы цитогенетического мониторинга (контроля), реально работающие во многих странах, в том числе и у нас. Они позволяют следить за уровнем мутагенных воздействий
факторов окружающей среды на наследственность человека. Для целей клиники анализ хромосомных аберраций помогает оценить отрицательные эффекты применяемой терапии и корректировать длительность применения того или иного лекарственного средства.
Рис. 7.5. Метафазная пластинка. Стрелками указаны парный фрагмент и дицентрическая хромосома
Для описания нормального кариотипа человека, а также для обозначения структурных и количественных перестроек хромосом используется определенная универсальная схема и специальные символы. Описание кариотипа начинают с указания общего числа хромосом в клетке, затем ставится запятая и обозначается набор половых хромосом, который указывает пол обследуемого, в случае патологии далее ставится запятая, а затем обозначается хромосомная аномалия. Например, запись 46,XX характеризует нормальный кариотип женщины, 46,XY - нормальный кариотип мужчины, 47,XX,+21 кариотип больного с синдромом Дауна. Иногда при обследовании обнаруживают так называемый нормальный полиморфизм хромосом - индивидуальные особенности их строения. Как правило, полиморфизм отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников и спутничных нитей в области коротких плеч акроцентрических хромосом и их величину. В большинстве случаев наличие полиморфизма строения хромосом не приводит к возникновению патологических симптомов у их обладателя. Однако следует отметить, что иногда при наличии нормального полиморфизма хромосом может увеличиваться риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями. Выявление полиморфизма хромосом обозначается при записи кариотипа. Например, запись 46,XX9gh+ означает увеличение размера гетерохроматинового участка в длинном плече хромосомы 9 женщины.
Изучение нормального полиморфизма хромосом может иметь значение для определения родительского происхождения хромосомной перестройки. Если установлено, от кого из родителей унаследован полиморфизм хромосом, то это обязательно указывается при записи кариотипа. Например, 46XY15ps+pat означает, что мужчиной унаследованы от отца увеличенные спутники на хромосоме 15.
Методы цитогенетической диагностики, применяемые в клинической генетике, часто используются в комплексе с другими методиками лабораторной диагностики, дополняя друг друга. Это позволяет более точно диагностировать сложные проявления наследственных и врожденных заболеваний человека. В нашей стране, как и во всем мире, цитогенетические методы прочно вошли в арсенал необходимых диагностических процедур для решения сложных дифференциально-диагностических задач практически во всех областях медицины. Особое же значение эти методы имеют при оказании помощи больным педиатрического, акушерско-гинекологического и эндокринологического профилей. Все вопросы назначения того или иного цитогенетического исследования осуществляются при медико-генетическом консультировании. В целом же все практические проблемы, решаемые лабораторными цитогенетическими методами, можно свести к следующим:
•подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике;
•наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития, не относящихся к генному синдрому;
•многократные спонтанные аборты, мертворождения или рождение детей с врожденными пороками развития;
•нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.);
•существенная задержка умственного и физического развития ребенка;
•пренатальная диагностика (риск по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребенка с хромосомной болезнью);
•подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью;
•лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза течения);
•оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических). Участие цитогенетиков в анализе трудных с диагностической точки зрения случаев часто приводит к более точной диагностике и,
соответственно, к своевременному лечению и предупреждению рождения больного ребенка.
7.2.2. Биохимические методы
Биохимические показатели отражают сущность наследственной болезни точнее, чем клиническая симптоматика. При биохимической диагностике оценивается фенотип организма на молекулярном уровне, а наследственная болезнь в конечном счете и есть фенотип. Поэтому биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике многих моногенных болезней. Однако сложность диагностики заключается в том, что сотни наследственных болезней по некоторым биохимическим показателям мочи или крови могут быть сходными (например, ацидоз, протеинурия и т.д.). Определять для каждого больного многие метаболиты очень трудоемко и дорого. Знание общих характеристик изменений обмена веществ при разных наследственных болезнях позволило по-новому построить исходную схему обследования, исходя из клинической картины болезни, генеалогических сведений и плана биохимического анализа. Такой подход позволяет проводить обследование на основе поэтапного исключения определенных классов болезней (просеивающие методы).
В биохимической диагностике наследственных болезней используются как классические биохимические методы (электрофорез, хроматография, спектроскопия), так и современные высокоточные технологии, такие как жидкостная хроматография, массспектрометрия, магнитнорезонансная спектрометрия, бомбардировка быстрыми нейтронами. Биохимическое обследование пациента позволяет идентифицировать любые метаболиты, специфические для той наследственной болезни, с подозрением на которую он был направлен. Каждое обследование должно начинаться с составления плана, в основе которого лежит клинико-генетическая информация о пациенте и его семье. «Объектами» биохимической диагностики являются биологические жидкости: моча, пот, плазма и сыворотка крови, эритроциты, лейкоциты, культуры фибробластов, лимфоцитов.
Практически во всех случаях биохимическая диагностика начинается с просеивающего подхода, в котором выделяют два уровня: первичный и уточняющий. Каждый из этих уровней может быть более или менее полным в зависимости от оснащенности лаборатории.
Основная цель первичного уровня диагностики заключается в том, чтобы исключить здоровых индивидов из дальнейшего обследования. Различают два вида программ первичной биохимической диагностики: массовые и селективные. На первом этапе в таких программах используются моча и кровь.
Существуют массовые просеивающие программы диагностики среди новорожденных фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, врожденной гиперплазии надпочечников, муковисцидоза, галактоземии. Биологическим материалом для диагностики является кровь. Высушенные капли капиллярной крови новорожденных на хроматографической или фильтровальной бумаге пересылают из родильных домов в лабораторию (можно по почте). Материал должен поступить в лабораторию в течение двух-трех дней после взятия пробы.
Для диагностики фенилкетонурии кровь новорожденных берут в родильном доме на 3-5 день после рождения. Если кровь будет взята раньше, то возможны ложноположительные результаты. В лаборатории в пятнах крови определяют количество фенилалани-на с помощью любого из следующих методов: микробиологический тест Гатри, флюорометрия, распределительная хроматография на бумаге, тонкослойная хроматография. Между методами нет принципиальной разницы, поэтому каждая лаборатория выбирает более подходящий для ее условий метод. Опыт показал, что пропущенные случаи фенилкетонурии являются не ошибками лабораторных исследований, а следствием недобросовестности или небрежности
в работе медицинских сестер при взятии крови в родильных домах. В случае положительного результата на фенилкетонурию проводится уточняющая биохимическая диагностика путем количественного определения фенилаланина в крови.
Врожденный гипотиреоз (снижение функции щитовидной железы) может быть обусловлен разными причинами: агенезия щитовидной железы; эктопия щитовидной железы; наследственные формы дисгормоногенеза; аутоиммунные процессы. Клинически врожденный гипотиреоз проявляется задержкой умственного развития, резким отставанием в росте, отечностью кожных