4 курс / Дерматовенерология / Папуло_пустулезная_форма_розацеа_у_женщин_Хворик_Д

средней, у 25 (67,6±7,7%) – с тяжелой, то есть с одинаковой частотой. Следует отметить, что у 18 пациентов с продолжительностью патологического процесса менее года D. follicullorum не обнаруживался, в то время как при длительности заболевания от 1 до 5 лет частота обнаружения демодекса составила 14,1±3,9%, а при длительности заболевания более 5 лет – еще больше (40,6±8,5%; p<0,01).

Заключение. Представленные в настоящей главе исследования позволили выявить некоторые особенности ППР у женщин на современном этапе:

1.Средний возраст пациентов с ППР среди лиц старше 18 лет составляет по значению медианы 38 лет при средней длительности заболевания 42 месяца. Максимальная продолжительность дерматоза у женщин установлена в возрасте старше 50 лет, при этом, чем старше пациент, тем длительнее течение дерматоза. Частота выявления D. follicullorum составило 60,2±4,3%.

2.В области локализации патологических изменений у пациентов чаще других отмечаются следующие кожные симптомы: зуд кожи (60,9±4,3%), жжение (45,3±4,4%), приливы жара (33,6±4,2%), стягивание кожи (28,9±4,0%), болезненность в области высыпаний (21,1±3,6%). Ведущими факторами дебюта дерматоза были психоэмоциональное перенапряжение и стресс, применение различных косметических средств, инсоляция, а рецидива, кроме перечисленных факторов, еще и тепловые процедуры, употребление раздражающей желудок пищи, алкогольных, горячих напитков.

3.Клиническая картина ППР характеризовалась наличием папул и пустул на фоне стойкой эритемы, телеангиэктазий преимущественно в области щек, подбородока, лба.

~ 51 ~

Глава 4 ЛАБОРАТОРНЫЕ КРИТЕРИИ ДИАГНОСТИКИ

СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ПАПУЛО-ПУСТУЛЕЗНОЙ ФОРМЫ РОЗАЦЕА

4.1 Состояние перекисного окисления липидов и антиокcидантной защиты у пациентов с папуло-пустулезной формой розацеа

Активация ПОЛ с последующим развитием состояния окислительного стресса является одним из патогенетических звеньев воспалительных заболеваний различной этиологии, в том числе и при ППР. Проявлению повреждающего действия неадекватного количества свободных радикалов и продуктов ПОЛ противостоит система антиоксидантов, включающая ферментативное и неферментативное звенья. Активность окислительного стресса зависит не только от уровня генерации свободных радикалов и концентрации продуктов ПОЛ, но и от состояния собственной АОС, которая элиминирует избыток последних. Оценка механизмов развития свободнорадикальной патологии позволит обосновать терапевтическую стратегию, направленную на снижение генерации активных форм кислорода, ведущую к снижению потенциала антиоксидантной защиты.

Активность свободнорадикальных процессов оценивали по содержанию первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов ПОЛ в плазме крови и эритроцитарной массе [101, 102, 106, 107, 109, 174, 250]. Материалом для исследования была венозная кровь.

Уровень ДК определяли по интенсивности поглощения липидным экстрактом монохроматического светового потока в области спектра 232–234 нм, характерного для конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов [14, 23, с. 205–206]. К 0,2 мл исследуемого биологического материала добавляли 6,0 мл гептан-изопропиловой смеси (2:1), приготовляемой ex tempore, и встряхивали в течение 15 минут. Далее в пробирку вливали 1,0 мл раствора HCl с pH 2,0 и повторно встряхивали. После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут отбирали

~ 52 ~

где V1 – объем водной фазы;

V2 – объем вносимого биологического материала; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.

При оценке первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов пероксидации липидов в гемолизате эритроцитов и плазме крови у пациентов с легкой степенью тяжести ППР достоверных различий с аналогичными показателями контрольной группы не установлено

(p>0,05) (таблица 4.1).

В гемолизате эритроцитов пациентов со средней степенью тяжести ППР по сравнению с контролем наблюдалось достоверное повышение показателей как первичных (ДК) (11,6±0,33 ед/мл, р<0,01), так и вторичных (МДА) (10,5±0,28 мкмоль/л, p<0,05) продуктов ПОЛ. В отношении плазмы крови достоверных различий в содержании ДК и МДА не выявлено (таблица 4.1).

При оценке аналогичных показателей у пациентов с тяжелой степенью тяжести ППР установлено повышение (в 1,2 раза) концентрации ДК (12,8±0,53 ед/мл и 10,3±0,35 ед/мл соответственно;

р<0,001) и МДА (11,5±0,41 мкмоль/л и 9,6±0,25 мкмоль/л

соответственно; p<0,001) в эритроцитах у пациентов 3-й группы по сравнению с контрольной, что, возможно, обусловлено дальнейшей активацией и накоплением свободных радикалов. В плазме крови у пациентов данной группы выявлено достоверное повышение концентрации МДА (1,9±0,14 мкмоль/л и 1,5±0,08 мкмоль/л соответственно; p<0,05) по сравнению с контролем (таблица 4.1).

Активизация процессов накопления свободных радикалов у пациентов возрастала с утяжелением клинической картины заболевания, что подтверждалось достоверным увеличением продуктов ПОЛ от 1-й к 3-й группе. Так, анализ результатов исследования пациентов 2-й и 1-й групп позволил выявить достоверно более высокие концентрации ДК (11,6±0,33 ед/мл и 9,8±0,46 ед/мл соответственно; p<0,01) и МДА (10,5±0,28 мкмоль/л и 9,5±0,25 мкмоль/л соответственно; p<0,05) в гемолизате эритроцитов у пациентов 2-й группы по сравнению с 1-й. При сравнении полученных данных у пациентов со средней и тяжелой степенью

~ 54 ~

окраски оценивали на спектрофотометре «Solar» PV1251C при длине волны 540 нм против контрольной пробы, в которую вместо супернатанта добавляли 1,0 мл дистиллированной воды и вносили реактив Грисса. Концентрацию общих нитритов рассчитывали по калибровочному графику, построенному с известными количествами NaNO2. Результаты выражали в мкмоль/л.

При оценке содержания суммарных нитрат/нитритов установлено их повышение у пациентов с разной степенью тяжести дерматоза. Так, у лиц с легким течением заболевания показатель составил 11,3±0,6 мкмоль/л, что было статистически значимо больше (p<0,01), чем в контрольной группе (9,4±0,39 мкмоль/л). По мере утяжеления клинического течения заболевания уровень содержания суммарных нитрат/нитритов увеличивался, составляя у лиц со средней степенью тяжести 13,0±0,6 мкмоль/л, а при тяжелой – 14,9±0,71 мкмоль/л (рисунок

4.1).

Примечания –

1 – * – различия с показателями контрольной группы достоверны (p<0,05);

2 – # – различия между показателями 1-й и 2-й групп, 1-й и 3-й групп достоверны

(p<0,05);

3 – @ – различия между показателями 2-й и 3-й групп достоверны (p<0,05)

Рисунок 4.1. – Уровень суммарных нитрат/нитритов у женщин с разной степенью тяжести ППР и контрольной группы

Таким образом, изменения активности ПОЛ сопровождаются ростом концентрации суммарных нитрат/нитритов, что подтверждает участие L-аргинин-NO системы в патогенезе ППР. Повышение уровня суммарных нитрат/нитритов на фоне утяжеления клинического течения заболевания доказывает NO-

~ 56 ~

зависимый характер возникающего окислительного стресса и свидетельствует о его диагностической ценности при оценке степени тяжести заболевания

С помощью ROC-анализа установлены точки разделения. Для уменьшения вероятности ложноотрицательных результатов при выборе уровня разделения приоритет отдавался специфичности. Площадь под ROC-кривой, построенной для разделения показателей суммарных нитрат/нитритов при дифференцировке легкой степени тяжести ППР и контрольной группы, составила 0,65 (0,54-0,75). Оптимальная точка разделения равнялась 11,3 (чувствительность – 40,5 (25,6-56,7), специфичность – 82,9 (67,9- 92,8)). Площадь под ROC-кривой при дифференцировке ППР легкой и средней степени тяжести составила 0,62 (0,51-0,72). Оптимальная точка разделения равнялась 12,9 (чувствительность – 53,1 (38,3–67,5), специфичность – 69,1 (52,9-82,4)). Площадь под ROC-кривой при дифференцировке ППР средней и тяжелой степени тяжести составила 0,63 (0,52–0,73). Оптимальная точка разделения равнялась 14,8 (чувствительность – 51,4 (34,4-68,1),

специфичность – 71,4 (56,7–83,4)).

Таким образом, предельные интервалы уровня суммарных нитрат/нитритов при легкой степени тяжести ППР составляют от 11,3 до 12,9 мкмоль/л, при средней – от 13,0 до 14,8 мкмоль/л, при тяжелой – более 14,9 мкмоль/л. Рост показателей активности свободнорадикального окисления липидов при утяжелении степени тяжести розацеа является информативным диагностическим критерием оценки прогрессирования заболевания, а также показанием к назначению адекватной терапии.

Для изучения показателей АОС у пациентов с ППР проводилось определение уровня церулоплазмина, ретинола, α- токоферола в плазме крови, а также восстановленного глутатиона, активности каталазы и СОД в эритроцитарной массе [95, 101, 102, 106, 108, 110].

Активность СОД в гемолизатах оценивали по степени ингибирования скорости реакции аутоокисления адреналина в присутствии исследуемого препарата относительно контрольной пробы [74]. К 2,0 мл карбонатного буфера добавляли 0,1 мл 0,1% раствора адреналина (5,46 мМ аптечный раствор), тщательно и быстро перемешивали, помещали в спектрофотометр «Solar» PV1251C и измеряли величину оптической плотности при длине

~ 57 ~

347 нм через 30 секунд в течение 3 минут относительно пробы без адреналина. При работе с гемолизатами в кювету к 2,0 мл буфера добавляли 0,01 мл исследуемого гемолизата и затем 0,1 мл 0,1% раствора адреналина, перемешивали и измеряли нарастание оптической плотности как описано выше. В контрольную пробу, относительно которой проводилось измерение, также добавляли 0,01 мл этого же гемолизата, но не вносили раствор адреналин, % ингибирования вычисляли по формуле:

где ∆Dопыт и ∆Dконтроль – скорости реакции аутоокисления адреналина, соответственно, в присутствии и отсутствии

гемолизата эритроцитов.

Активность СОД выражали в условных единицах на г Hb. За 1 условную единицу принимали 1% ингибирования.

При анализе полученных показателей ферментативного звена АОС установлено достоверное снижение активности основного внутриклеточного антиоксиданта – СОД – в эритроцитах пациентов

1-й (43,5±2,01%, p<0,01), 2-й (40,7±1,94%, p<0,001) и 3-й

(36,71±2,05%, p<0,001) групп по сравнению с контрольной группой (50,3±1,38%). Кроме того, отмечено достоверное снижение активности изучаемого фермента у пациентов с тяжелой степенью тяжести ППР по сравнению с легкой (p<0,05) (таблица 4.2).

Таблица 4.2. – Показатели антиоксидантной системы в эритроцитарной массе у женщин с разной степенью тяжести ППР

Примечания –

1 – * – различия с показателями контрольной группы достоверны (p<0,05);

2 – # – различия между показателями 1-й и 2-й групп, 1-й и 3-й групп достоверны

(p<0,05)

~ 58 ~

Для определения активности каталазы в гемолизатах использовали метод М. Королюк [44], основанный на спектрофотометрической регистрации количества окрашенного продукта реакции Н2О2 с молибденовокислым аммонием, имеющим максимальное светопоглощение при длине волны 410 нм. B опытной пробе к 2,0 мл 0,03% Н2О2 добавляли 0,1 мл гемолизата (разведение 1:600), в контрольной пробе вместо перекиси водорода использовали дистиллированную воду. В холостой пробе к Н2О2 вместо биологического материала добавляли 0,1 мл Н2О. Пробы перемешивали и 10 минут инкубировали при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония и спектрофотометрировали на «Solar» PV1251C при длине волны 410 нм. Активность каталазы рассчитывали по формуле:

где Ахол и Аоп – экстинкция холостой и опытной проб; V1 – объем инкубированной смеси;

t – время инкубации;

k – коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода при 410 нм.

В эритроцитах активность каталазы выражали в моль Н2О2/мин/г Hb. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 ммоль продукта за 1 минуту в условиях испытания.

При изучении активности каталазы в эритроцитах у пациентов 1-й группы выявлена тенденция к ее снижению (29,9±0,42 ммоль Н2О2/мин/г Hb и 30,5±0,53 ммоль Н2О2/мин/г Hb соответственно; p>0,05) по сравнению с контролем. Активность данного ферментативного антиоксиданта у пациентов со средней степенью

группе. Его минимальные значения установлены у пациентов с тяжелым течением ППР (27,5±0,54 ммоль Н2О2/мин/г Hb, p<0,001) по сравнению с контрольной группой. При оценке активности

~ 59 ~

каталазы в изучаемых группах выявлено достоверное ее снижение во 2-й и 3-й группах по сравнению с 1-й (таблица 4.2).

Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах изучали по модифицированному методу J. Sedlak и R. Lindsay [216]. В основе метода лежит реакция взаимодействия SH-групп глутатиона с 5,5’-дитиобис (2-нитробензойной кислотой) (ДТНБ), способной поглощать свет при длине волны 412 нм. Формально этот метод позволяет определять суммарную концентрацию низкомолекулярных тиолов. Однако, поскольку GSH является доминирующим (около 95% от всех низкомолекулярных тиолов в клетке), то по результатам реакции с ДТНБ чаще всего судят о

раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Все это тщательно перемешивали и центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. К 0,2 мл центрифугата добавляли 1,2 мл 0,2 М калий-фосфатного буфера (рН 7,4) и 0,05 мл 0,01 М ДТНБ, через 10 минут измеряли на спектрофотометре «Solar» PV1251C при длине 412 нм против пробы, обработанной так же, но не содержащей биологического материала. При расчете использовали коэффициент молярной экстинкции, равный 13 600. Содержание GSH в эритроцитах выражали в мкмоль/г Hb.

Что касается концентрации восстановленного глутатиона в группах с разной степенью тяжести ППР, то она не имела статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой (таблица 4.2).

Основную антиоксидантную функцию в плазме крови выполняет неферментативный антиоксидант церулоплазмин [9]. Его высокая феррооксидазная активность предотвращает неферментативные реакции, дающие начало свободным радикалам и дальнейшему развитию ПОЛ [12].

Уровень церулоплазмина определяли методом Равина, принцип которого базируется на окислении p-фенилендиамина при участии церулоплазмина [23, с. 74-75]. Окисленный диамин, соединяясь с диметилпарафенилендиамином, дает окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна ферментативной активности церулоплазмина. В пробирки вносили

~ 60 ~