Глава 5. Молекулярный скрининг генетического риска.

С середины 20-го столетия получила развитие концепция обследования здоровой популяции. Скрининг (просеивание) новорожденных является примером такого рода. Общим для программ скрининга является раннее выявление болезни, когда ее клинические проявления практически отсутствуют. Для этого традиционно использование широкого спектра современных лабораторных методов - биохимических, иммунологических, цитологических и др.

Успехи Проекта Геном человека и молекулярно-генетических (МГ) технологий открыли еще один путь обследования здоровых людей. МГ анализ позволяет анализировать генотип индивидуума и тем самым определять наличие мутаций, ассоциированных с заболеванием. Эта информация может быть получена задолго до клинической манифестации болезни. Такое исследование позволяет идентифицировать гетерозиготные состояния, которые могут не проявляться клинически, но дают риск иметь пораженное потомство. Эта информация используется прежде всего в случае моногенных заболеваний, наследующимся согласно законам Менделя.

О МГ скрининге для выявления полигенных, мультифакториальных заболеваний, пока говорить преждевременно ввиду недостаточности сведений о природе и характере взаимодействующих генетических элементов, их полиморфизме, мутациях и т.д. Таким образом, наиболее частые, глобальные болезни, такие как сахарный диабет, гипертоническая болезнь или атеросклероз, остаются за рамками МГ скрининга.

Очевидно, что МГ скрининг целесообразен только в случае заболевания с тяжелым клиническим течением, частота которого известна, этиология и патогенез изучен. Ген, изменения в котором лежат в основе заболевания, должен быть охарактеризован, а спектр мутаций известен. Мутации должны быть четко ассоциированы с заболеванием, иметь высокую пенетрантность, а количество их должно быть ограниченным. Однако для введения скрининга важно не столько формальное соблюдение вышеназванных условий, сколько реальное повышение качества жизни выявленных скринингом пациентов. Что касается лабораторного метода, то желательно, чтобы он был недорогим, информативным и приемлемым для популяции. Важным моментом является определение адресности скринируемой популяции, для которой должен быть установлен возраст, пол, этническая принадлежность и др. Первой, абсолютно необходимой стадией скрининга, во многом определяющей результат скрининга, является широкое информирование адресной популяции о целях, задачах и ожидаемых результатах программы скрининга.

В таблице 1. приведены болезни-кандидаты для МГ скрининга, для которых в США МГ скрининг введен в общей популяции или в отдельных этнических группах, или проблема находится в стадии обсуждения.

Скрининг на носительство рецессивной болезни идентифицирует гетерозигот с целью оценки репродуктивного риска болезни у их потомства. Зачастую семейная история заболевания отсутствует и только больной ребенок становится показателем гетерозиготности родителей. Поскольку в случае чисто рецессивных заболеваний большинство гетерозигот асимптоматично, а биохимические характеристики, как правило, не позволяют их идентифицировать, то сделать это можно только с помощью ДНК-анализа. Факт гетерозиготного статуса открывает необходимость медико-генетического консультирования семьи, пренатальной диагностики при последующих беременностях и дает право выбора, позволяющего избежать рождения больного ребенка.

Таблица 1.

Болезни–кандидаты для молекулярно-генетического скрининга

Болезнь	Частота носителей в некоторых популяциях
Муковисцидоз	1/29
фактор Y Лейдена	1/14
наследственный гемохроматоз	1/10
термолабильная метилен- тетрагидрофолатредуктаза	1/7
фрагильная Х-хромосома	1/200
болезнь Гоше	1/15
болезнь Канавана	1/36
злокачественная гипертермия	?
Атаксия-телангиектазия	1/100
HIV-резистентность (ССR5)	1/10

Муковисцидоз является наиболее характерным примером для пан-этнического МГ скрининга, введенного в ряде штатов США в 2001 году после долгого обсуждения и планирования программы, а также серии пилотных исследований. Отрицательными сторонами скрининга в этом случае являются гетерогенность гена CFTR (более 1000 мутаций), клиническая вариабельность заболевания и отсутствие четкой зависимости фенотипа от генотипа. В настоящий момент репродуктивным парам предлагают панель для скрининга на 25 мутаций с возможностью дальнейшей пренатальной диагностики.

Синдром фрагильной Х-хромосомы, который часто классифицируют как рецессивный, в действительности является полудоминантным, так как 50% женщин-носительниц мутации неспособны к обучению и имеют другие характерные признаки заболевания, а клиническая картина у пораженных мальчиков также очень вариабельна. Популяция для скрининга - женщины репродуктивного возраста и беременные женщины. В Европе, Израиле и США проведен ряд пилотных исследований.

Успешным можно назвать скрининг на гетерозиготность в отношении болезни Тея-Сакса - одну из аутосомно-рецессивных наследственных болезней, частота которых высока в популяции евреев-ашкенази.

Скрининг на носительство бета-талассемии в странах Средиземноморья развертывался подобным образом. Однако программа скрининга в популяции афроамериканцев США на носительство гемоглобинопатий - серповидноклеточной анемии и гемоглобина С - признана неудовлетворительной по ряду социальных причин.

Целью скрининга на рецессивные болезни является не вышеописанное выявление асимптоматических носителей и их консультирование, а идентификация лиц, у которых в дальнейшем могут возникнуть клинические проявления заболевания. Для чисто рецессивного наследования это гомозиготы и компаундные гетерозиготы.

Пример – разработанная в настоящее время в США панель тестов для идентификации ряда форм наследственной тромбофилии. Одна из форм - недостаточность фактора 5 Лейдена (НФ5Л), основой которой является миссенс-мутация, манифестирует во взрослом возрасте. Частота носительства в кавказской популяции (европейцы) - 5-7% и менее 1,5% в других этнических группах. Риск венозного тромбоза у гетерозигот в 7 раз, а у гомозигот - в 80 раз выше, чем в общей популяции. Одно из проявлений - выкидыши у женщин. Высокая частота и возможность лечения с помощью антикоагулянтов делает НФ5Л привлекательной для скрининга, который к тому же приводил бы к выявлению мутации у родственников пораженных индивидуумов, как это хорошо аргументировано для муковисцидоза. Однако терапия с помощью постоянного введения антикоагулянтов, которая сама по себе не безразлична, в условииях неполной пенетрантности ограничивает введение общего скрининга на мутацию НФ5Л. Применение тестирования на это состояние признано целесообразным только в отношении лиц с соответствующей симптоматикой в возрасте до 50 лет и женщин с частыми выкидышами.

"Тромбофилическая" панель тестов может быть дополнена тестом на замену 677С→Т в гене метилентетрагидрофолатредуктазы. Поскольку эта замена встречается у 30-40% общей популяции, то обозначается как вариантная форма, при которой синтезируется термолабильный фермент, приводящий к умеренному повышению уровня гомоцистеина в крови, что увеличивает риск сердечно-сосудистой патологии. Однако более приемлемым методом для этого остается прямое измерение концентрации гомоцистеина в крови.

Мутация гена HFE, связанного с локусом HLA на хромосоме 6, приводит к накоплению железа, наследственному гемохроматозу. Наиболее частой мутацией является C282Y, носители которой составляют 10-15% популяции Северной Европы. Другие мутации ассоциируются с заболеванием только будучи в компаунде с C282Y. Заболевание может являться кандидатом для популяционного скрининга молодых взрослых индивидуумов. Однако рекомендуемым методом скрининга является не молекулярно-генетический анализ, а традиционное измерение растворения трансферрина, поскольку позволяет выявлять большее число положительных пациентов.

Скрининг на аутосомно-доминантные болезни в целом не признан целесообразным, поскольку доминантная мутация проявляется в родословной. Эффективное лечение для многих доминантных болезней, особенно неврологических, пока не разработано (хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера и др.), а сообщение неблагоприятного прогноза здоровому, молодому человеку - задача этически трудная и неблагодарная. Кроме того, неполная пенетрантность идентифицированной мутации снижает значимость теста. Эти же доводы относятся и к популяционному скринингу с целью раннего выявления семейного рака.

Скрининг на фармакогенетический риск.

Фармакогенетические исследования стали главной темой в последние годы проекта Геном человека. Целью фармакогенетических исследований является анализ вариантов полиморфизма, которые определяют индивидуальную реакцию пациента на химиотерапию. Наиболее известные заболевания из этой группы - порфирии, метгемоглобинемия и недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (фавизм). Однако популяционный скрининг в США на эти болезни не актуален. Для США к обсуждению для МГ скрининга предложена злокачественная гипертермия, которая дает о себе знать только при применении некоторых анестетиков во время хирургической операции и проявляется в неожиданном резком подъеме температуры в сочетании со спазмом мышц и ацидозом. За это состояние отвечают не менее пяти локусов, но 80% всех случаев охватывают мутации в гене рецептора рианодина RYR1. Европейским Консорциумом предложена на рассмотрение панель тестов на 15 мутаций в этом гене, прежде всего для обследования членов семьи, имеющих риск.

Признан целесообразным молекулярный скрининг на мутацию A1555G митохондриального генома, которую связывают с повышением чувствительности к аминогликозидным антибиотикам, вызывающим потерю слуха.

Кандидатом для МГ скрининга может являться также атаксия-теленгиэктазия, в частности гетерозиготы, частота которых оценивается от 1:100 до 1:20 и которые имеют повышенную предрасположенность к раку и повышенную чувствительность к радиации.

Интерес представляет мутация CCR5 рецептора бета-хемокина поверхности клетки, результатом которой является повышенная устойчивость гомозигот к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и замедление течения этой инфекции у гетерозигот. Аргументы о скрининге на эту мутацию противоречивы.

Возможен скрининг работодателем принимаемых на работу с целью, например, выявления индивидуумов, чувствительных к определенным внешнесредовым воздействиям (химическим, радиоактивным, инфекциям и др.).

Как уже обсуждалось, возможности МГ скрининга в настоящее время сосредотачиваются на моногенных болезнях. Результаты анализа на моногенное заболевание носят качественный характер - мутация есть или ее нет. В ситуации с полигенной болезнью вовлеченные в патологический процесс гены и мутации могут иметь эффект, подобный количественному - в степени функции целого ряда генов, их взаимодействии и т.д. По причине большого числа генов, мутаций, вариантов полиморфизма при ДНК-тестировании необходимо анализировать много параметров одновременно. Такого рода технологией являются ДНК-чипы, разработка которых все более приближаются к медицинской практике.

Во многих случаях разница между относительно благоприятным вариантом полиморфизма и вызывающей болезнь мутацией известна, что открывает возможность для приемов превентивной медицины в области и полигенных болезней человека.

Проектное задание:

1. Подготовьте реферат на тему «Медико-генетическое консультирование как метод профилактики наследственных болезней».

2. Подготовьте реферат на тему «Использование методов генной терапии при лечении и профилактике наследственных болезней».

Тесты рубежного контроля

1. Под первичной профилактикой наследственных болезней понимают:

А) прерывание беременности

Б) пренатальную диагностику

В) предупреждение рождения больного ребенка

Г) биохимический скрининг

2. Под вторичной профилактикой наследственных болезней понимают:

А) проявления патологических генотипов

Б) прерывание беременности

В) коррекцию проявления патологических генотипов

Г) молекулярно-генетические исследования

3. Под третичной профилактикой наследственных болезней понимают:

А) прерывание беременности

Б) молекулярно-генетические исследования

В) коррекцию проявления патологических генотипов

Г) биохимический скрининг

4. Дополнительным источником наследственных болезней может служить:

А) индуцированный мутагенез

Б) некачественная пища

В) соматические заболевания

Г) вирусные инфекции

5. При каких наследственных заболеваниях используется третичная профилактика:

А) фенилкетонурия

Б) врожденный гипотиреоз

В) хорея Гентингтона

Г) альбинизм

Д) целиакия

6. Фармакогенетические исследования проводятся с целью определить:

А) индивидуальную реакцию пациента на вирусные инфекции

Б) индивидуальную реакцию пациента на лекарственные препараты

В) генетический риск наследственной патологии

Г) предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям

7. Под генной терапией понимают:

А) введение нормального аллеля в геном

Б) удаление аномального гена из всех клеток организма

8. Скрининг на аутосомно-доминантные болезни в целом не признан целесообразным, в связи с:

А) отсутствием методов диагностики

Б) неполной пенетрантностью идентифицированной мутации

В) высокой стоимости исследований

Г) отсутствием достаточного количества оборудования

9. Молекулярно-генетический скрининг наследственных болезней целесообразен при всех условиях кроме:

А) заболевания с тяжелым клиническим течением

Б) известна частота заболевания

В) изучена этиология и патогенез заболевания

Г) отсутствие методов лечения

10. Первичная профилактика наследственных болезней реализуется через все перечисленное, кроме:

А) планирование деторождения путем выбора оптимального репродуктивного возраста

Б) отказа от деторождения в случаях высокого риска наследственной и врожденной патологии

В) отказ от деторождения в кровном браке, в случае гетерозиготного носительства патологического гена

Г) проведение биохимического скрининга

Д) жесткий контроль содержания мутагенов и тератогенов в окружающей среде.

Список литературы

1. Бочков Н.П. Клиническая генетика. Учебник. М. :ГЭОТАР-МЕД. 2001.- 448с.

2. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.- СПб.: «Специальная литература», 1977.-287с.

3. Козлова С.И., Демикова Н.С. Наследственные сидромы и медико-генетическое консультирование. – М.: Товарищество научных изданий КМК: Авторская акдемияю-2007.-448с.

4. Лазюк Г.И. Тератология человека. М. Медицина.-1991 - 448с.

5. Приходченко Н.Н., Шкурат Т.П. Основы генетики человека. Ростов-на-Дону: Феникс, 1997. – 368с.

6. Фогель Ф. Мотульски А. Генетика человека. М.: Мир. 1989. Т.1, 2, 3.

7. Wayne W. Grody Molecular genetic risk screening // Annu. Rev. Med. 2003, 54:473-90.

www.geneticlinics.org – обзоры по наследственным заболеваниям

www. rusmedserv.com переведенные обзоры из Geneticlinics.org

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/OMIM -каталог наследственных болезней

Модуль 2. Преимплантационная профилактика наследственных болезней.

Комплексная цель: Ознакомиться с преимплантационной генетической диагностикой (ПГД), как методом профилактики наследственной патологии. Рассмотреть этапы проведения ПГД. Изучить лабораторные методы исследований, применяемые для преимплантационной диагностики.

Идея применения методов преимплантационной генетики в клинической практике возникла давно. Еще в 1967 г. R.Edwards и R.Gardner успешно определяли пол у эмбрионов кролика, находящихся на стадии бластоцисты, и затем переносили их в полость матки. Уже тогда эти ученые предсказывали применение аналогичных технологий у человека во избежание передачи наследственных заболеваний от родителей детям. Однако это стало возможным лишь в начале 90-х годов, когда была разработана техника полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяла определять мутации в единичных клетках. Первыми ПЦР для преимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинической практике применили А.Handyside и соавт. в 1990 г. С помощью ПЦР они детектировали специфические последовательности для хромосомы Y при определении пола эмбрионов у супружеских пар с Х-сцепленными заболеваниями. Однако из-за риска постановки неправильного диагноза при определении пола эмбрионов от ПЦР постепенно стали отказываться в пользу другого метода - флюоресцентной (нерадиоактивной) гибридизации in situ (FISH). Его преимущество заключалось в том, что можно было одновременно детектировать как X-, так и Y-хромосомы, и, как следствие, появилась возможность определять не только пол эмбрионов, но и анеуплоидии половых хромосом. С тех пор за достаточно короткое время разработано много модификаций ПЦР и FISH, расширяется область применения этих методов в ПГД.

На сегодняшний день при преимплантационной диагностике осуществляется диагностика моногенных и хромосомных дефектов у ооцитов и эмбриона. Преимплантационная диагностика разработана для ж енщин, имеющих высокий риск рождения детей с наследственной патологией, как альтернативный метод пренатальной диагностики. До появления преимплантационной генетической диагностики единственным вариантом для таких женщин было проведение амниоцентеза (аспирации небольшого количества амниотической жидкости - жидкости, окружающей плод в матке. Амниотическая жидкость содержит клетки плода, которые в последующем культивируются в течение 2-3 недель и исследуются на наличие генетических аномалий). Главный недостаток амниоцентеза заключается в том, что, если плод является носителем заболевания, супругам необходимо принять решение о том, будут ли они прерывать беременность или сохранять беременность, зная, что у них родится больной ребенок. ПГД дает таким парам возможность выбора. Главным преимуществом преимплантационной диагностики является возможность отказа от инвазивных вмешательств на плодном яйце и прерывания беременности в случае выявления патологии. Исследования могут быть проведены на полярных тельцах ооцитов и/или ядрах бластомеров эмбриона. Диагностика эмбриона проводится в цикле экстракорпорального оплодотворения до его переноса в полость матки.

При ПГД из эмбриона извлекают одну или две клетки, а затем проводят их генетический анализ методом FISH (fluorescent in situ hybridization) на анеуплоидии, транслокации и другие структурные патологии. Другой тип диагностики - полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая применяется для диагностики моногенных заболеваний. ПЦР проходит в два этапа:

1) биопсия эмбриона и фиксация бластомера;

2) генетическая диагностика.