6 курс / Гастроэнтерология / Российский_журнал_гастроэнтерологии,_гепатологии,_колопроктологии (4)

щий эффект на гидролитическо-транспортную функцию тонкой кишки при резекции желудка по Б-II более выражен, чем после операции по Б- I. Это объясняется тем, что при операции по Б-I сохраняется естественный пассаж химуса через желудочно-кишечный тракт, а при операции по Б-II довольно значительная часть кишки (двенадцатиперстная кишка и определенная часть проксимального отдела тонкой кишки) изолируется

от пищеварения. Это обстоятельство вызывает более выраженную компенсаторную гиперфункцию оставшейся части тонкой кишки [3].

Следовательно, наши результаты могут служить основой для разработки целенаправленной диетотерапии язвенной болезни до и после операции путем адекватного подбора соответствующих углеводов в рационе.

1.Адаменко И.А. Морфофункциональные изменения в эндокринном аппарате поджелудочной железы после оперативных вмешательств на желудке // Хирургия. – 1984. – № 9. – С. 53–55.

2. Белоконев В.И., Павлишин Л.Б., Морозова О.В. и др. Лечение нарушений эвакуаторной функции желудка после операций при язвенной болезни // Хирургия. – 1998. – № 3. –

С.17–20.

3.Бут Ю.С., Елощенко С.Н., Добровольский А.И. Структурное обеспечение адаптивных процессов в тонкой кишке при хирургическом лечении язвенной болезни гастродуоденальной зоны // Структурное обеспечение и стимуляция компенсаторно-приспособительных реакций. – Омск, 1989. – С. 92–95.

4.Буянова В.М., Янгиев А.Х., Ашурова М.Р., Даутов С.Б. Микрофлора желудочно-кишечного тракта при хирургическом лечении язвенной болезни // Рос. мед. журн. – 1992. – № 4. –

С.47–49.

5.Каретерс Дж. М. Мальабсорбция // Патофизиология органов пищеварения. – СПб: Бином и Невский Диалект, 1997. – С. 121–164.

6.Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1979. – 280 с.

7.Кузин М.М., Алимов А.Н., Гордеев В.Ф., Майорова Ю.Б. Состояние секреторной, эвакуаторной функции желудка и дуоденогастрального рефлюкса у больных язвенным стенозом двенадцатиперстной кишки после различных типов операций // Хирургия. – 1997. – № 8. – С. 28–31.

8.Лохвицский С.В., Дарвин В.В., Прошин А.В. и др. Оценка результатов хирургического лечения язвенной болезни, ассоцированной с Helicobacter pylori // Вестн. хир. – 1998. – № 2. – С. 18–20.

9.Мизунов Н.А. Функциональные изменения печени у больных до и после резекции желудка по поводу язвенной болезни // Клин. хир. – 1986.

– № 11. – С. 54–55.

10.Уголев А.М., Зарипов Б.З., Иезуитова Н.Н. и др. Особенности мембранного гидролиза и транспорта в тонкой кишке в условиях, близких к физиологическим (ревизия существующих данных и представлений) // Биол. мембраны. – 1984. – № 10. – С. 997–1018.

11.Dahlqvist A. Assay of intestinal disaccharidases // Anal. Biochem. – 1968. – Vol. 22, № 1. – P. 99–107.

12.Okabe S. et al. A method for experimental penetrating and duodenal ulcer in rats // Amer. J. Dig. Dis. – 1971. – Vol. 16. – P. 277–284.

Несмотря на многочисленные публикации, многие вопросы патогенеза хронических вирусных гепатитов (ХВГ) остаются предметом дискуссии. В по-

следние годы особый интерес вызывают результаты изучения унифицированного механизма клеточной гибели – апоптоза, путем которого осуществляется элиминация инфицированных вирусом гепатоцитов [1, 5].

В то же время данные о разнообразных системных проявлениях ХВГ, о возможности внепеченочной репликации вирусов гепатитов В и С (HBV, HCV) в тканях лимфоидного и нелимфоидного происхождения [4, 10], а также об изменении системного баланса провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [3, 7] позволяют предполагать возможность усиленной деструкции путем апоптоза и других клеточных популяций.

Ранее было продемонстрировано повреждение ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови у больных ХВГ В [2].

Цель настоящего исследования – изучение апоптоза указанных типов клеток у больных ХВГ В и С и определение его связи с нарушением структуры нативной ДНК.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика пациентов. В исследование включены 34 больных ХВГ (26 мужчин, 8 жен-

щин). Их средний возраст – 42 года (от 18 до 68 лет). У 12 диагностирован ХВГ В, из них у 7

– ДНК HBV (+), у 5 – на стадии цирроза. У 22 больных выявлен ХВГ С: у 13 – РНК HCV (+), у 7 – на стадии цирроза.

Диагноз ХВГ устанавливали на основании результатов стандартного комплекса биохимических, вирусологических, инструментальных и гистологических исследований. Критериями исключения служили тяжелые заболевания других органов и систем, ВИЧ-инфекция, а также предшествующее применение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов.

Контрольная группа представлена 10 здоровыми донорами без признаков патологии печени и с отрицательными результатами анализов на маркеры HBV- и HCV-инфекций.

Характеристика методов. Лимфоциты и гранулоциты выделяли из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования и очищали от эритроцитов с использованием осмотического шока в ледяной бане.

Структуру ДНК клеток исследовали прямым флюоресцентным методом с бромистым этидием в качестве флюорофора на флюориметре „Jasco FP 550“ при длине волны возбуждения 520 нм и эмиссии 590 нм. Оценивалась скорость щелочной денатурации ДНК в процентах ДНК, остающейся в двунитевой форме через 1 ч инкубации лизата клеток в щелочном растворе при температуре 15оС.

Клетки в состоянии апоптоза (гиподиплоидных клеток со сниженной по сравнению с дипло-

Таблица 1. Скорость щелочной денатурации ДНК лейкоцитов,

% (p±mp)

* Отличия от контроля достоверны, р < 0,05.

Таблица 2. Частота апоптоза гранулоцитов у больных хроническим

вирусным гепатитом, % (p±mp)

* Отличия от контроля достоверны, р<0,05.

Таблица 3. Частота апоптоза лимфоцитов у больных хроническим

вирусным гепатитом, % (p±mp)

* Отличия от контроля достоверны, р<0,05.

гранулоцитах больных ХВГ, определяемое по скорости щелочной денатурации, достоверно ниже, чем в контрольной группе. Для лимфоцитов наблюдалась аналогичная тенденция, хотя достоверных отличий по этому показателю не получено.

Результаты исследования апоптоза гранулоцитов представлены в табл. 2. Как непосредственно после выделения, так и после суточной инкубации в апоптоз переходило существенно больше гранулоцитов, выделенных от больных ХВГ, причем за счет пациентов с положительным анализом на нуклеиновые кислоты вирусов в сыворотке (ДНК HBV, РНК HCV).

Аналогично показатели апоптоза лимфоцитов были достоверно выше при ХВГ как у свежевыделенных клеток, так и после 24 ч инкубации. При этом опять наиболее выраженным был апоптоз при наличии сывороточных нуклеиновых кислот вирусов HBV и HCV (табл. 3).

Разделение больных на подгруппы в зависимости от этиологии позволило выявить аналогичные результаты в каждой из подгрупп

идными флюоресценцией) выявляли методом проточной цитофлюорометрии на аппарате EPICS-C при длине волны возбуждения 488 нм и эмиссии 680 нм с последующим подсчетом по программе STAT PACK. Клетки подсчитывали как непосредственно после выделения, так и после 24-часовой инкубации в культуральной среде RPMI-1640, содержавшей 20% фетальной сыворотки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из представленных в табл. 1 данных следует, что относительное содержание двунитевой ДНК в

(табл. 4).

Гистограммы распределения клеток в состоянии апоптоза у здоровых доноров и больных ХВГ представлены на рис. 1 и 2.

У больных ХВГ С содержание лимфоцитов в состоянии апоптоза было достоверно выше как непосредственно после выделения (8,8±1,8%), так и после суточной инкубации (18,2±3,2%) по сравнению с таковым у больных ХВГ В (5,9±1,7 и 10,0±2,9% соответственно, р<0,05). Для гранулоцитов получены сходные результаты (табл. 4).

Подгруппы больных ХВГ с наличием и отсутствием цирроза не отличались ни по апоптозу, ни по повреждению ДНК лейкоцитов.

повышенная системная секреция TNF-α при ХВГ

Ви С [3, 7].

Как известно, TNF-α является одним из веду-

щих проапоптогенных факторов, осуществляющих свое действие посредством связи с соответствующим рецептором. Имеются данные об усиленной продукции TNF-α под воздействием вирусов, в том числе HBV и HCV [9], что может служить объяснением интенсификации апоптоза при наличии виремии.

Различия по показателям апоптоза лейкоцитов у больных ХВГ В и С могут быть связаны с различной интенсивностью системного воспалительного ответа при этих нозологических формах, хотя определенное влияние, вероятно, оказывает и

разное количество больных в указанных группах. Особый интерес представляет корреляция количества лимфоцитов и гранулоцитов, перешедших в состояние апоптоза после суточной инкубации в культуральной среде, со скоростью щелочной денатурации ДНК свежевыделенных клеток, отражающей степень повреждения ее двунитевой структуры. Установлено, что образование разрывов ДНК является ранним маркером апоп-

тоза [8].

Следовательно, накопление лейкоцитов с разрывами ДНК является ранним признаком их перехода в апоптоз, то есть повреждение ДНК может служить маркером “апоптогенной готовности” клеток.

1.Аруин Л.И. Апоптоз и патология печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 1998. – Т. 8, № 2. – С. 6–11.

2.Змызгова А.В., Москалева Е.Ю., Максимов С.Л. и др. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и показатели клеточного иммунитета больных вирусным гепатитом В // Вопр. биол. мед. фарм. химии. – 1999. – № 2.

– С. 16–20.

3.Маммаев С.Н., Лукина Е.А., Левина А.А. и др. Цитокины и острофазовые белки сыворотки крови у больных хроническим вирусным гепатитом С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2000. – Т. 10, № 1, прил. № 7. – С. 22.

4.Chisari F.V., Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis // Ann. Rev. Immunol. – 1995. – Vol. 13. – P. 29–60.

5.Feldman G. Liver apoptosis // J. Hepatol. – 1997. – Vol. 22. – P. 1–11.

6.McGahon A.J., Seamus J.M., Reid P. et al. The end of the cell line: methods for the study of apoptosis in vitro // Meth. Cell Biol. – 1995. – Vol. 46. – P. 153–187.

7.Nelson D.R., Lim H.L., Marousis C.G. et al. TNF-α system activation in chronic hepatitis C virus infection // Dig. Dis. Sci. – 1997. – Vol. 42. – P. 2487–2494.

8.Peitsch M.C., Muller C., Tschop J. DNA fragmentation during apoptosis is caused by frequent single-strand cuts // Nucl. Acids Res. – 1993. – Vol. 21. – P. 4206–4209.

9.Rosenberg W. Mechanisms of immune escape in viral hepatitis // Gut. – 1999. – Vol. 44. – P. 759–764.

10.Zignego A.L., Brechot C. Extrahepatic manifestations of HCV infection: facts and controversies // J. Hepatol. – 1999. – Vol. 31. – P. 369–376.

Полиморфность клинических проявлений острого панкреатита (ОП) – от развития эндотоксических реакций до выраженных метаболических наруше-

ний – свидетельствует в пользу того, что в патогенезе данной патологии существенное значение имеют гуморальные нарушения [2, 6, 33].

Основным патогенетическим звеном в развитии перечисленных патологических состояний являются активация нейтрофильных лейкоцитов и увеличение проницаемости сосудистой стенки [3, 14, 32]. Эти данные, а также частое развитие экстрапанкреатических нарушений при ОП позволяют предположить наличие специфических гуморальных медиаторов, в частности цитокинов, эффекты которых способствуют развитию панкреатических и системных поражений [24, 26, 31, 35].

Известно также, что при развитии воспалительных реакций в организме существенные альтерирующие эффекты оказывает оксид азота (NO) [9, 23, 24]. Выявлено его цитотоксическое действие. Отмечается, что при синтезе NO в условиях воспаления данное соединение индуцирует вазодилатацию, локальное поражение паренхимы органа, подверженного воспалению, и его ишемию [4, 34, 36].

Эффекты, вызываемые NO, являются таковыми и для недавно показанных механизмов развития острого воспаления поджелудочной железы [7, 8]. Интересным представляется факт индукции синтеза NO под влиянием цитокининдуктивной формы NO-синтазы – одного из ключевых энзимов синтеза оксида азота [20].

С целью проверки гипотезы о взаимодействии и взаимодополнении продукции интерлейкинов и синтеза NO в патогенезе острого экспериментального панкреатита (ОЭП) были проведены серии исследований. Дополнительной задачей исследования послужило исследование роли NO в механизмах формирования экспериментальной модели ОП путем торможения активности NO-синтазы введением NG-нит- ро-L-аргинина.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар. Их питание осуществлялось по обыкновенной диете в условиях вивария.

Крысам был обеспечен свободный доступ к пище и воде, их содержали в стандартных условиях с естественной 12-часовой сменой света и темноты. Работу проводили с соблюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов.

ОЭП моделировали у крыс, наркотизированных каллипсолом в дозе 0,2 мг/кг внутрибрюшинно (“Gedeon Richter”, Венгрия), путем повреждения поджелудочной железы, доступ к которой обеспечивался при лапаротомии [1]. Контрольными считались ложнооперированные животные. Кроме того, выделили группу сравнения,

Динамика концентрации ИЛ-1β (пг/мл) в сыворотке крови крыс в течение 5 сут с момента воспроизведения острого экспериментального панкреатита в логарифмическом изображении: по оси абсцисс – дни с момента воспроизведения панкреатита, по оси ординат – концентрация ИЛ-1β

Пик концентрации ИЛ-1 приходится на 3-и сутки течения острого экспериментального процесса в паренхиме поджелудочной железы и составляет 445±30 пг/мл, что в 2,7 раза превышает аналогичный показатель у крыс через 24 ч те-

чения ОЭП (р<0,001). Начиная с 4-х суток ОЭП величина исследуемого показателя снижается. Так, на 5-е сутки его величина составляет 64% от той, которая отмечалась на 3-и сутки (р<0,05).

У крыс через 1 ч после моделирования ОЭП активность амилазы в крови в 3,2 раза (р<0,001) превышала таковой показатель в контрольной группе животных (табл. 2).

Через 3 ч данный показатель возрос в 5,5 раза (р<0,001), через 9 ч – в 6,5 раза (р<0,001). Через 2 сут с момента воспроизведения ЭОП исследуемые показатели в контрольной и опытной группах различались в 13,2 раза (табл. 2). В случае введения NG-нитро-L-аргинина (10 и 20 мг/кг) исследуемые показатели через 24 ч течения ОЭП были меньше, чем у крыс с ОЭП в 13,6 и 14 раз соответственно (р<0,001).

Аналогичную тенденцию имела динамика концентрации глюкозы в крови. Так, через 1 ч после воспроизведения ОЭП данный показатель в опытной группе превышал таковой в контроле в 2,4 раза (р<0,01, табл. 3).

С течением времени существенно нарастала концентрация глюкозы; исследуемые показатели