81
(a) |
(б) |
(в) |
(г) |
(д) |
(е) |
(ж) |
(з) |
(и) |
(к) |
Рис. 3.33. ДНК-кометы после электрофореза клеток в микрогеле. (а) —
положительный контроль (H2O2), (б) — отрицательный контроль (PBS), (в–к) —
соединение 1.57 (C = 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100 и 200 мкМ).
com/.https://meduniver - МедУнивер сайтом изучению к Рекомендовано
82
Табл. 3.10. Влияние соединения 1.57 на процентное содержание ДНК в хвосте кометы, длину хвоста и хвостовой момент. С
— молярная концентрация соединения 1.57.
|
|
|
|
|
Амплитуда / % |
|
|
|
||
Изучаемая |
Отрицательный |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
С (H2О2) / |
|
|
|
С / мкM |
|
|
||||
характеристика |
контроль |
мкM |
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
100,0 |
1,0 |
10,0 |
25,0 |
50,0 |
75,0 |
100,0 |
200,0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Хвост ДНК / % |
5,81 ± 0,91 |
81,41 ± |
6,65 ± |
12,36 |
13,81 |
21,94 ± |
26,87 ± |
29,84 ± |
41,87 ± |
|
7,31 |
1,12 |
± 1,31 |
± 1,45 |
3,18 |
3,27 |
3,54 |
3,57 |
|||
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Длина хвоста / |
55,13 ± 6,34 |
573,01 ± |
81,12 |
82,78 |
85,39 |
141,61 |
215,67 |
300,01 ± |
455,33 ± |
|
мкм |
10,24 |
± 7,84 |
± 8,69 |
± 8,31 |
± 12,47 |
± 18,39 |
20,59 |
39,7 |
||
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Хвостовой |
10,45 ± 3,69 |
533,11 ± |
5,39 ± |
10,23 |
11,79 |
31,07 ± |
57,95 ± |
89,52 ± |
190,65 ± |
|
момент |
96,19 |
0,09 |
± 0,11 |
± 0,12 |
0,40 |
0,60 |
0,73 |
1,42 |
||
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
82
83
3.5.5. Цитотоксичность соединения 1.57
После 48 ч инкубации клеток линии почки эмбриона человека (HEK293) [112]
с соединением 1.57 отмечалось снижение выживаемости клеток практически на 50%
в изученном диапазоне концентраций (Рис. 3.34а). При этом наблюдалось снижение выживаемости опухолевых клеточных линий: аденокарциномы печени человека
(SK-HEP-1; Рис. 3.34б) и глиобластомы человека (T98G; Рис. 3.34в) в присутствии соединения 1.57.
(а)
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
/ % |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Выживаемость |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
2 |
10 |
20 |
50 |
100 |
150 |
200 |
|
|
|
|
C / мкМ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(б) |
|
|
|
|
120 |
|
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
/ % |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
Выживаемость |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
2 |
10 |
20 |
50 |
100 |
150 |
200 |
|
|
|
|
C / мкМ |
|
|
|
|
|
|
|
|
(в) |
|
|
|
|
|
120 |
|
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
/ % |
80 |
|
|
|
|
|
|
|
Выживаемость |
60 |
|
|
|
|
|
|
|
40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
2 |
10 |
20 |
50 |
100 |
150 |
200 |
|
|
|
|
C / мкМ |
|
|
|
|
Рис. 3.34. Влияние соединения 1.57 на выживаемость клеток линии HEK293 (а), SK-HEP-1 (б), T98G (в). C — молярная концентрация соединения 1.57.
В Табл. 3.11 представлено сравнение значений IC50 для соединения 1.57, и
известных цитостатиков: доксорубицина и цисплатина на различных клеточных линиях. Как видно из Табл. 3.11, наиболее выраженное цитотоксическое действие
84
соединения 1.57 наблюдается в отношении клеточной линии А549. Следует отметить, что соединение 1.57 имеет более широкое терапевтическое окно, чем доксорубицин и цисплатин. Этот факт подтверждается значением IC50, полученным для контрольной линии HEK293.
Табл. 3.11. Значение IC50 для соединения 1.57, доксорубицина и цисплатина на клеточной линии эмбриональной почки человека (HEK293), карциномы лёгкого
(А549), тератокарциномы яичника человека (PA-1 B5), глиобластомы человека
(T98G), аденокарциномы печени человека (SK-HEP-1).
Наименование клеточной линии
|
HEK293 |
А549 |
PA-1 B5 |
T98G |
SK-HEP-1 |
|
|
|
|
|
|
Соединение 1.57 |
46,6 |
13,7 |
48,0 |
44,9 |
22,2 |
Доксорубицин |
77,2 |
46,9 |
29,1 |
2,01 |
42,3 |
Цисплатин |
0,01 [102] |
18,9 |
3,60 |
34,8 |
50,2 |
|
|
|
|
|
|
3.5.6. Митохондриальный потенциал
Как известно из литературы, механизм цитотоксического действия доксорубицина включает как минимум две мишени: ингибирование активности топоизомеразы II, приводящее к подавлению репликации ДНК и ингибирование комплекса I электрон-транспортной цепи, что приводит к падению митохондриального потенциала и, соответственно, к повреждению митохондрий.
Было установлено, что в клеточной линии PANC-1 доксорубицин снижает мембранный потенциал митохондрий на 45 ± 5 % по сравнению с контролем. В
случае соединения 1.57 не наблюдалось статистически значимого влияния на величину митохондриального мембранного потенциала в клеточной линии PANC-1.
Таким образом, на основании результатов предыдущих исследований можно сделать вывод, что ключевым механизмом цитостатического действия соединения 1.57
является повреждающее действие на молекулу ДНК.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
85
3.6.Изучение физико-химических свойств водных растворов соединения 3.6
3.6.1.Стабильность соединения 3.6 в водных растворах
На следующем этапе работы было проведено исследование стабильности тетразолсодержащего производного 1,3,5-триазина — соединения 3.6 в растворе DCl
в D2O (C = 10−3 М, pH 10). В кислой среде наблюдались значительные изменения в спектрах 1Н ЯМР. Так, было зафиксировано уменьшение интенсивности сигналов,
соответствующих протонам СН3-групп (1,40–1,42 м. д.), вплоть до полного их исчезновения в спектре. Данные изменения спектральных характеристик указывают на гидролиз диоксанового цикла с образованием 2-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-
триазин-2-ил)амино)-3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил-2-(5-фенил-2H-
тетразол-2-ил)ацетата (соединение 3.7) (Схема 3.8). Также наблюдалось смещение сигнала протонов метиленовой группы с 5,48 м. д до 5,53 м. д. [111].
Схема 3.8
3.7.Изучение биосовместимости соединения 3.6
3.7.1.Исследование гемосовместимости
3.7.1.1.Гемолиз
Для оценки гемосовместимости соединения 3.6 изучали его влияние на спонтанный гемолиз. Влияние соединения 3.6 на гемолиз определяли по оценке высвободившегося гемоглобина. На Рис. 3.35 показано влияние вещества 3.6 (C = 10–100 мкМ) на гемолиз эритроцитов через 1 и 3 ч инкубации. Показано, что соединение 3.6 при инкубации в течение 1 и 3 ч вызывало незначительный гемолиз в изученном диапазоне концентраций; при этом интенсивность гемолиза зависела от
86
дозы и времени. Как было указано ранее, вещества не обладают гемолитической активностью в том случае, если процент гемолиза не превышает 5 %. Следовательно,
соединение 3.6 можно считать гемолитически неактивным в изученном диапазоне концентраций [111].
|
0.8 |
|
|
|
|
|
% |
|
|
|
|
|
|
)100 |
0.6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
) / A |
|
|
|
|
|
|
контроль |
0.4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
− A |
|
|
|
|
|
|
тест |
|
|
|
|
|
|
((A |
0.2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.0 |
|
|
|
|
|
|
0 |
10 |
25 |
50 |
75 |
100 |
|
|
|
|
C / мкМ |
|
|
Рис. 3.35. Влияние соединения 3.6 на гемолиз (светло-серый — через 1 ч, тёмно-
серый — 3 ч).
3.7.1.2. Агрегация тромбоцитов
Анализ Табл. 3.12 показывает, что в эксперименте по агрегации тромбоцитов с использованием в качестве индуктора АДФ, присутствие соединения 3.6 в
диапазоне концентраций 5–100 мкМ не оказывает статистически значимого влияния на функциональную активность тромбоцитов [111].
Табл. 3.12. Влияние соединения 3.6 на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме.
Амплитуда, %
С / мкM
Контроль |
5 |
10 |
25 |
50 |
75 |
100 |
60,2 ± 1,1 |
54,2 ± 1,9 |
57,6 ± 3,2 |
54,75 ± 0,9 |
66,45 ± 7,8 |
63,6 ± 7,7 |
64,1 ± 4,8 |
|
|
|
|
|
|
|
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
87
3.7.1.3. Плазмо-коагуляционный гемостаз
Данные, представленные в Табл. 3.13 демонстрируют наличие у соединения
3.6 антикоагулянтных свойств, что характеризуется статистически значимы
увеличением АПТВ и ПВ в изученном диапазоне концентраций.
Табл. 3.13. Влияние соединения 3.6 на показатели плазмо-коагуляционного гемостаза. C — молярная концентрация вещества 3.6.
С / мкМ
|
Контроль |
5 |
10 |
|
25 |
|
50 |
|
75 |
|
100 |
200 |
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
АПТВ / |
45,1 ± 1,5 |
42,3 ± |
49,8 |
± |
44,1 |
± |
59,2 |
± |
63,3 |
± |
68,0 ± |
80,7 ± |
c |
|
0,1 |
0,3 |
|
1,6* |
0,9* |
1,6* |
1,2 |
1,2 |
|||
ПВ / c |
14,6 ± 1,9 |
57,4 ± |
62,2 |
± |
60,7 |
± |
60,5 |
± |
61,0 |
± |
64,2 ± |
66,2 ± |
|
|
0,7 |
1,2 |
|
1,3 |
|
1,4 |
|
1,2 |
|
1,3 |
1,2 |
TB / c |
12,5 ± 1,3 |
11,5 ± |
11,9 |
± |
11,8 |
± |
11,9 |
± |
11,4 |
± |
13,4 ± |
13,1 ± |
|
|
1,3 |
1,2 |
|
1,4 |
|
1,9 |
|
1,3 |
|
1,3 |
1,2 |
*статистически значимо относительно контроля (p < 0,05).
3.7.2.Изучение связывания соединения 3.6 с ДНК и ЧСА
3.7.2.1.Изучение термодинамических параметров связывания с ДНК и ЧСА
калориметрическим методом
На Рис. 3.36 представлена зависимость теплового эффекта реакции взаимодействия тетразолсодержащего производного 1,3,5-триазина — соединения
3.6 с ДНК при 298,15 К в зависимости от объёма добавленного титранта (соединение
3.6). На основе термодинамической модели независимого связывания были рассчитаны параметры взаимодействия соединения 3.6 с ДНК. Рассчитанная константа связывания соединения 3.6 с ДНК, равная 4,08·108 М−1, свидетельствует об образовании устойчивого комплекса. Полученные значения термодинамических параметров: H = −17,18 кДж·моль−1; S = 108,6 Дж∙(моль∙К)−1; G = −49,55
88
кДж·моль−1) показывают, что взаимодействие соединения 3.6 c ДНК является экзотермическим процессом. При этом отрицательное значение G свидетельствует о самопроизвольности процесса образования комплекса соединения 3.6 с ДНК [111].
H / мкДж
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.5
-2.0
0.0 |
0.1 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
C3.6 / C ДНК
Рис. 3.36. Зависимость теплового эффекта реакции взаимодействия соединения 3.6
с ДНК при 298,15 К. H — тепловой эффект реакции, C3.6 / CДНК — соотношение концентраций соединения 3.6 и ДНК.
3.7.2.2. Изучение термодинамических параметров связывания с ДНК
спектрофотометрическим методом
Ранее было показано, что один из возможных механизмов противоопухолевого действия производного 1,3,5-триазина — соединения 1.57 —
обусловлен связыванием с молекулой ДНК, приводящим к её повреждению [98].
На Рис. 3.37 приведены спектры поглощения ДНК в физиологическом растворе (0,9 % NaCl) при постоянной концентрации ДНК (C = 6,1 мкM) и различных концентрациях соединения 3.6. Установлено, что при увеличении концентрации соединения 3.6 в УФ-спектрах наблюдается гипохромный эффект,
свидетельствующий о том, что соединение 3.6 взаимодействует с ДНК. Также были получены УФ-спектры растворов с различными концентрациями ДНК (2,3, 4,9, 8,3,
12,0, 13,0 и 13,9 мкМ) в присутствии соединения 3.6 (C = 2,34 мкM; Рис. 3.38).
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
|
|
|
|
89 |
|
|
|
|
|
1,2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1,0 |
|
|
|
1,0 |
|
|
|
A / a.u. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,8 |
|
|
|
0,8 |
|
|
|
|
|
|
|
/ a.u. |
|
|
|
|
|
|
l A/ нм 260 |
|
0,6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
A |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
230 |
240 |
250 |
260 |
270 |
280 |
290 |
300 |
|
|
|
|
l / нм |
|
|
|
|
Рис. 3.37. Спектры поглощения растворов ДНК (C = 6,1 мкM) в зависимости от
концентрации соединения 3.6 (C = 3,89–12,3 мкМ).
|
0.5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Чсм |
28 |
|
y = 2.1274x - 6.276 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
2 |
|
|
R² = 0.9863 |
|
|
|
|
|
|
|
M |
23 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
/ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10 |
18 |
|
|
|
|
|
|
0.4 |
|
|
)}Ч |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
f |
13 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
− |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
a |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
8 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
]/( |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
{[ДНК |
3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A / a.u. |
|
|
|
|
-2 |
1 |
6 |
[ДНК] / мкМ |
11 |
16 |
0.3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
220 |
240 |
260 |
280 |
300 |
320 |
340 |
|||
|
|
|
|
l / нм |
|
|
|
|
|
|
Рис. 3.38. Спектры поглощения растворов ДНК (C = 2,63–13,9 мкМ) при постоянной концентрации соединения 3.6 (C = 2,34 мкM), а также зависимость в координатах [ДНК] / (εa − εf) от [ДНК] (R2 = 0,986).
Как показано на Рис. 3.39, зависимость в координатах [ДНК] / (εa − εf) от [ДНК]
является линейной. Полученное значение константы связывания (Kbin = 9,65·108 М−1)
свидетельствует об образовании прочного комплекса соединения 3.6 с ДНК [112].
Изучение температуры плавления ДНК методом УФ-спектрофотомерии в присутствии соединения 3.6 показало, что соединение 3.6 практически не влияет на температуру плавления ДНК: температура плавления ДНК с 64,5°C изменяется до
65,1 °C в присутствии соединения 3.6 ( Tm = 0,6°C; Рис. 3.39). Это свидетельствует
90
о том, что соединение 3.6 практически не оказывает влияния на стабильность двухцепочечной структуры ДНК.
1.25 |
|
|
|
|
|
|
|
0.006 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1.20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.004 |
1.15 |
|
|
|
|
|
|
|
/ Ad |
A |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
td |
1.10 |
|
|
|
|
|
|
|
0.002 |
1.05 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.000 |
1.00 |
|
|
|
|
|
|
|
|
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
|
|
|
Температура / °C |
|
|
|
||
Рис. 3.39. Кривые плавления ДНК (C = 6,1 мкМ) в отсутствие и в присутствии соединения 3.6 при соотношении [соединение 3.6] / [ДНК] = 1,5.
Спектр КД раствора ДНК состоит из положительной полосы при 275 нм,
обусловленной стекинг-взаимодействием нуклеотидов внутри одной спирали ДНК,
и отрицательной полосы при 246 нм, связанной с хиральностью правозакрученной спирали В-формы ДНК [101]. Метод спектроскопии КД может использоваться для определения типов взаимодействий различных лигандов с ДНК. Спектры КД растворов были получены при постоянной концентрации ДНК (C = 6,1 мкM) и при различных концентрациях соединения 3.6 (3,9, 6,1, 8,1 и 12,3 мкM). Как видно из Рис. 3.40, увеличение концентрации соединения 3.6 в растворе приводит к уменьшению интенсивности поглощения положительной полосы и незначительному уменьшению интенсивности поглощения отрицательной полосы.
Наблюдаемые изменения в спектрах КД могут указывать на то, что тетразолсодержащее производное 1,3,5-триазина (3.6) способно нарушать стекинг-
взаимодействия между нуклеотидами в ДНК-дуплексе [103].
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/