61
метаболизма и замедлением выведения. Также высокая липофильность даёт возможность легко проникать через кожу (трансдермальное применение) [96].
Распределение соединения 1.57 в системе н-октанол – вода изучали при равных объёмах водной и органической фаз (25,0 мл), выполняя 4 параллельных опыта. Перемешивание фаз в термостатируемой ячейке длилось 4 ч, после чего отбирали аликвоту нижней водной фазы. Содержание соединения 1.57 в водной фазе определяли спектрофотометрически.
|
|
c' |
|
c |
- c' |
|
|
P |
= |
o |
= |
w |
o |
, |
(3.18), |
c' |
|
|
|||||
ow |
|
|
|
c' |
|
||
|
|
w |
|
|
w |
|
|
где cо´ и cw´ — концентрации соединения 1.57 в органической и водной фазах,
соответственно; сw — начальная концентрация соединения 1.57 в воде.
Значение логарифма коэффициента распределения соединения 1.57
составило: lgPow = 0,16. Полученное значение показывает, что соединение 1.57
имеет практически одинаковое сродство к водной и органической фазам. Анализ литературы выявил наличие расчётного значения коэффициента распределения соединения 1.57 в системе н-октанол – вода, полученного с использованием атомно-аддитивного метода XLOGP3-AA: lgPow = 0,1 [97]. Видно хорошее соответствие между расчётным и экспериментальным значением коэффициента распределения.
Считается, что величина lgPow между −1 и +2 является оптимальной для веществ, предназначенных для перорального применения. При низкой величине lgPow соединение будет плохо всасываться и как следствие иметь низкую биодоступность. Следовательно, соединение 1.57 можно считать пригодным и для перорального применения.
62
3.4.7. Изучение стабильности водных растворов соединения 1.57 методом
ЯМР-спектроскопии
При изучении потенциальных соединений-лидеров особое внимание уделяется их стабильности в водных средах. Одним из важных факторов,
влияющих на стабильность органических соединений является pH. Низкая стабильность лекарственных средств, как правило, связана с протеканием различных процессов деградации веществ (гидролиз, окисление, таутомеризация,
ферментативные превращения и др.) [11]. Данные процессы могут приводить к образованию продуктов, характеризующихся меньшей фармакологической активностью вплоть до её потери.
Устойчивость водных растворов соединения 1.57 изучалось методом спектроскопии 1Н ЯМР. На Рис. 3.17 представлены спектры 1Н ЯМР водного раствора соединения 1.57, записанные через определённые промежутки времени в автоматическом режиме. В нейтральной среде не было зафиксировано уменьшения интенсивности или смещения сигналов, соответствующих протонам исходного соединения 1.57 в течение суток, таким образом, можно сделать вывод о стабильности структуры 1.57 в водной среде в течение 24 ч [98].
Рис. 3.17. Спектры 1H ЯМР соединения 1.57 в D2O через 12, 16, 20 и 24 ч.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
63
Анализ литературных данных показывает, что соединения, содержащие в своей структуре 1,3-диоксановый фрагмент могут подвергаться гидролизу в присутствии кислотных катализаторов. При этом, электронодонорные заместители в положении 2 ускоряют скорость гидролиза. Так, соединение 1.57
может подвергаться гидролизу по Схеме 3.7 до 2-((4,6-бис(азиридин-1-ил)-1,3,5-
триазин-2-ил)амино)-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диола (3.7) [98].
Схема 3.7
Для подтверждения протекания гидролиза по механизму, представленному на Схеме 3.7, 20 мг соединения 1.57 растворяли в 40 мл водных растворах соляной и уксусной кислот (pH 1 и 3). Полученные растворы при комнатной температуре перемешивали в течение 45 мин. По окончании реакции растворитель удаляли при комнатной температуре и нормальном давлении. Продукт сушили на воздухе.
Методом ЯМР-спектроскопии было установлено, что при значениях pH 1 и 3 наблюдается исчезновение сигналов протонов CH3-групп (δ = 1,41–1,42 м. д), а
также наблюдается смещение химических сдвигов CH2-протонов азиридиновых циклов в сильное поле при pH 1 и 3 (от δ = 2,33 до 2,16 и 2,07 м. д., соответственно)
(Рис. 3.18). Образование продукта (3.8) так же было подтверждено методом масс-
спектрометрии [98].
64
Рис. 3.18. 1Н ЯМР-спектр соединения 1.57 при pH 1.
Аналогичным образом 20 мг соединение 1.57 растворили в 40 мл водного раствора 0,1 M NaOH (pH 10). Полученный раствор при комнатной температуре перемешивали в течение 1 ч. По окончании реакции растворитель удаляли при комнатной температуре и нормальном давлении. Продукт сушили на воздухе.
Однако, методом ЯМР-спектроскопии установлено, что заметного смещения сигналов не происходит. Таким образом, можно сделать вывод о стабильности соединения 1.57 в щелочной среде (Рис. 3.19) [98].
Рис. 3.19. 1Н ЯМР-спектр соединения 1.57 при pH 10.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
65
3.5.Биосовместимость соединения 1.57
3.5.1.Гемосовместимость
3.5.1.1.Гемолиз
Для оценки гемосовместимости соединения 1.57 было изучено его влияние на спонтанный гемолиз. В случае веществ, совместимых с кровью, мембрана эритроцита остаётся неповреждённой, а содержимое клетки не высвобождается.
Влияние соединения 1.57 на гемолиз определяли путём спектрофотометрического измерения высвобожденного гемоглобина.
На Рис. 3.20 показано, что соединение 1.57 при инкубации в течение 1 и 3
ч с эритроцитами не вызывает гемолиз в диапазоне концентраций от 10 до 200
мкМ. Следовательно, соединение 1.57 является гемолитически неактивным.
|
0.6 |
|
|
|
|
|
|
)Ч100 % |
0.5 |
|
|
|
|
|
|
0.4 |
|
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
) / A |
|
|
|
|
|
|
|
контроль |
0.3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
− A |
0.2 |
|
|
|
|
|
|
тест |
|
|
|
|
|
|
|
((A |
0.1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0.0 |
|
|
|
|
|
|
|
0 |
10 |
25 |
50 |
75 |
100 |
200 |
|
|
|
|
C / мкМ |
|
|
|
Рис. 3.20. Влияние соединения 1.57 на гемолиз (светло-серый — 1 ч,
тёмно-серый — через 3 ч).
3.5.1.2. Агрегация тромбоцитов
Как видно из данных, представленных в Табл. 3.6, в тесте АДФ-
индуцированной агрегации тромбоцитов соединение 1.57 в изученном диапазоне
66
концентраций статистически значимо по сравнению с контролем повышает агрегацию тромбоцитов; эффект не является дозозависимым.
Табл. 3.6. Влияние вещества 1.57 на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме.
|
|
|
Амплитуда / % |
|
|
|
Контроль |
|
С / мкМ |
|
|
||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
5 |
10 |
25 |
50 |
100 |
200 |
|
|
|
|
|
|
|
|
60,2 ± 2,4 69,9 ± 2,2* |
67,8 ± 3,1* |
68,3 ± 2,8* |
69,6 ± 3,3* |
71,4 ± 2,9* |
68,7 ± 2,7* |
|
*p < 0,05 по отношению к контролю.
3.5.1.3. Плазменно-коагуляционный гемостаз
Соединение 1.57 в концентрационном диапазоне 5–200 мкМ проявляет антикоагулянтные свойства в тесте АПТВ, статистически значимые по сравнению с контролем (Табл. 3.7). При этом соединение 1.57 не оказывало влияния на ТВ и ПВ в исследуемом концентрационном диапазоне.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
67
Табл. 3.7. Влияние соединения 1.57 на показатели плазмо-коагуляционного гемостаза.
Тест |
Норма |
Контроль |
|
|
|
С / мкМ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
5 |
10 |
25 |
50 |
75 |
100 |
200 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ТВ / сек |
15–19 |
17,1 ± 1,2 |
15,0 ± 0,9 |
15,2 ± 1,0 |
15,4 ± 0,8 |
15,6 ± 1,4 |
15,6 ± 0,7 |
15,8 ± 1,2 |
15,1 ± 2,1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
АПТВ / сек |
28–40 |
36,5 ± 2,0 |
41,9 ± 1,7* |
42,3 ± 2,2* |
44,5 ± 1,3* |
46,7 ± 1,8* |
43,3 ± 1,6* |
45,2 ± 2,1* |
42,7 ± 1,4* |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ПВ / сек |
13–18 |
13,6 ± 1,5 |
18,6 ± 2,1 |
18,5 ± 1,8 |
18,1 ± 2,0 |
18,0 ± 1,9 |
18,2 ± 2,2 |
18,5 ± 2,4 |
18,2 ± 2,1 |
*статистически значимо по отношению к контролю p < 0,05.
67
68
3.5.2.Изучение связывания с ДНК и ЧСА
3.5.2.1.Изучение связывания с ДНК и ЧСА калориметрическим методом
Сывороточный альбумин человека (ЧСА) является основным плазменным белком. Связывание с ЧСА контролирует свободную активную концентрацию препарата и может значительно влиять на общий фармакодинамический и фармакокинетический профиль [99,100]. Исследования связывания лекарств с белками важны как с теоретической, так и с практической точки зрения,
поскольку они позволяют лучше понять процессы, лежащие в основе распределения и выведения биологически активных веществ.
ЧСА имеет три основных сайта связывания лиганда: (1) сайт I,
расположенный в субдомене IIA (сайт связывания варфарина); (2) сайт II,
расположенный в субдомене IIIA (сайт связывания ибупрофена); (3) сайт II,
расположенный в субдомене IB (сайт связывания дигитонина).
Зависимость теплового эффекта реакции взаимодействия соединения 1.57
с ЧСА при 298,15 К от объёма добавленного титранта (соединение 1.57)
представлена на Рис. 3.21. Видно, что в этом случае имеет место эндотермический тепловой эффект, свидетельствующий об отсутствии взаимодействия соединения
1.57 с ЧСА. Данный тепловой эффект характеризует теплоту смешения титранта и титруемого вещества. Таким образом, при введении соединения 1.57 в кровоток,
ЧСА не будет с ним взаимодействовать и, следовательно, выполнять транспортную функцию. Данный факт может являться причиной высокой системной токсичности соединения 1.57.
Ещё одним из распространённых способов исследования механизма противоопухолевой активности является in vitro изучение взаимодействия биологически активных веществ с полинуклеотидами.
На Рис. 3.22 представлена зависимость теплового эффекта реакции взаимодействия соединения 1.57 с ДНК при 298,15 К в зависимости от объёма титранта (соединение 1.57). На основе полученных экспериментальных данных были рассчитаны параметры взаимодействия соединения 1.57 с ДНК с
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
69
использованием термодинамической модели независимого связывания
(Independent model) [100].
Полученное значение стехиометрии взаимодействия показывает, что в точке эквивалентности на 1 моль соединения 1.57 приходится 10 моль ДНК (Табл. 3.8). Это можно объяснить ассоциацией молекул ДНК в растворе. Скорее всего, 1
молекула соединения 1.57 взаимодействует с условным ассоциатом, содержащим
10 молекул ДНК.
|
|
|
|
|
|
|
(а) |
|
|
|
|
|
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
75 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H / мкДж |
50 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
25 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
12 |
14 |
16 |
18 |
20 |
22 |
|
|
|
|
|
Cсоединения 1.57 / CЧСА |
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
(б) |
|
|
|
|
20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
10 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
H / мкДж |
-10 |
|
|
|
|
|
|
|
-20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
-30 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
-40 |
|
|
|
|
|
|
|
|
-50 |
|
|
|
|
|
|
|
|
-60 |
|
|
|
|
|
|
|
|
-70 |
|
|
|
|
|
|
|
|
0.025 |
0.050 |
0.075 |
0.100 |
0.125 |
0.150 |
0.175 |
0.200 |
|
|
|
|
Cсоединения 1.57 / C ДНК |
|
|
|
|
Рис. 3.21. Зависимость теплового |
Рис. 3.22. Зависимость теплового |
эффекта реакции взаимодействия |
эффекта реакции взаимодействия |
соединения 1.57 с ЧСА при 298.15 К. |
соединения 1.57 с ДНК при 298.15 К. |
H — тепловой эффект реакции, |
H — тепловой эффект реакции, |
Ссоединения 1.57 / CЧСА — соотношение |
Ссоединения 1.57 / CДНК — соотношение |
концентраций соединения 1.57 и ЧСА. концентраций соединения 1.57 и ДНК.
Рассчитанная константа связывания соединения 1.57 с ДНК (Kbin = 6,65·107
М−1) свидетельствует об образовании ковалентного аддукта. Из представленных значений термодинамических параметров (Табл. 3.8) видно, что взаимодействие соединения 1.57 c ДНК является сильно экзотермическим процессом. В свою очередь отрицательное значение S свидетельствует о том, что добавление соединения 1.57приводит к упорядочению в растворе.
70
Табл. 3.8. Термодинамические характеристики связывания соединения 1.57 с
ДНК при 298,15 К. Kd — константа диссоциации, Kbin — константа ассоциации, n
— стехиометрический коэффициент связывания соединения 1.57 с ДНК, H, S, G — изменение энтальпии, энтропии и энергии Гиббса в реакции
взаимодействия соединения 1.57 с ДНК, T — абсолютная температура.
Термодинамический параметр |
Значение |
|
|
Kd / M |
1,51·10−8 |
N |
0,1 |
H / кДж/моль |
−788,5 |
S / Дж/моль∙К |
−2495,0 |
G / кДж/моль |
−44,65 |
−T S / кДж/моль |
743,8 |
Kbin / M−1 |
6,65·107 |
|
|
3.5.2.2. Изучение связывания с ДНК спектрофотометрическим методом
Методами УФ- и КД-спектроскопии изучено взаимодействие соединения
1.57 с ДНК. При наличии взаимодействия с ДНК в водных растворах 0,9 % NaCl
при pH 7.4 обычно наблюдаются характеристичные изменения в электронных спектрах поглощения. Характер вышеупомянутых изменений существенно зависит от типа взаимодействия. На Рис. 3.23 приведены спектры поглощения ДНК в физиологическом растворе (0,9 % NaCl) при постоянной концентрации ДНК (6,1 мкM) и различных концентрациях соединения 1.57.
Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/