1. Спектрофотометрический метод.
Многие субстраты или продукты ферментативных реакций поглощают свет либо в видимой, либо в ультрафиолетовой области спектра. Принцип метода заключается в измерении концентрации субстрата или продукта по величине оптической плотности раствора.
В большом количестве аналитических наборов используется оптический тест Варбурга, который основан на том, что один из продуктов дегидрогеназной реакции НАД·Н или НАДФ·Н имеет максимум поглощения при длине волны 340 нм, а их окисленные формы при этой длине волны практически не поглощают. Активность фермента эквивалентна приросту (или уменьшению) оптической плотности при этой длине волны.
2. Фотоколориметрический метод.
Позволяет измерить оптическую плотность окрашенного раствора, который поглощает свет в видимой области. Если субстрат или продукт ферментативной реакции сам не имеет окраски, то используется его химическая модификация с получением окрашенных производных.
3. Флуоресцентный метод.
Флавиновые соединения (а также НАД+) сильно флуоресцируют при воздействии на них светом определенной длины волны в окисленной форме и теряют эту способность при восстановлении. В методе часто используются специальные флуоресцентные метки и красители. Флуоресцентный метод позволяет существенно повысить чувствительность и расширить диапазон измерения по сравнению с оптическими методами измерения абсорбции.
4. Газометрический метод.
Используется для наблюдения за ходом реакций, в которых один из компонентов находится в газообразном состоянии. Наиболее современным является газометрический метод О. Варбурга, основанный на применении предложенного им аппарата с встроенным манометром для измерения давления газа. Метод используется для изучения оксидаз (поглощение О2), декарбоксилаз (выделение СО2) и др.
5. Титрометрический метод.
Титрометрический метод существует в алкалиметрическом или ацидометрическом варианте, то есть определении титра кислоты или щелочи, образовавшейся в ходе реакции. Например, один из методов определения активности ацетилхолинэстеразы основан на титровании количества уксусной кислоты, образовавшейся при ферментативном расщеплении ацетилхолина.
81
6. Поляриметрический метод.
Принцип метода основан на определении изменения удельного вращения раствора по мере протекания ферментативной реакции. Реакция проводится в трубке поляриметра.
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
ВЫБЕРИТЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ОТВЕТ
1. НЕОБРАТИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТА ВОЗНИКАЕТ, ЕСЛИ
а) фермент и ингибитор связаны ковалентно б) фермент и ингибитор связаны ионными связями
в) фермент и ингибитор связаны водородными связями г) между ферментом и ингибитором гидрофобное взаимодействие
2. АКТИВАТОРОМ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЯВЛЯЕТСЯ
а) тетраалкиламмоний хлористый б) ацетон в) хлористый кальций
г) хлористая ртуть д) карбофос
3.ПРЕДШЕСТВЕННИКОМ КОФЕРМЕНТА СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЯВЛЯЕТСЯ
а) витамин РР
б) витамин В1 в) витамин В2 г) витамин В6 д) витамин С
4.ПРЕДШЕСТВЕННИКОМ КОФЕРМЕНТА АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ ЯВЛЯЕТСЯ
а) витамин РР |
г) витамин В6 |
б) витамин В1 |
д) витамин С |
в) витамин В2 |
|
5.КАКОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ХАРАКТЕРИЗУЕТСЯ ТЕМ, ЧТО ИЗБЫТОК СУБСТРАТА ВЫТЕСНЯЕТ ИНГИБИТОР ИЗ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ФЕРМЕНТА
а) неконкурентное обратимое б) неконкурентное необратимое в) конкурентное обратимое г) конкурентное необратимое
82
6.КОНКУРЕНТНОЕ ОБРАТИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ВЫЗЫВАЕТ
а) янтарная кислота (сукцинат) б) фумаровая кислота (фумарат)
в) пировиноградная кислота (пируват) г) малоновая кислота (малонат)
д) лимонная кислота (цитрат)
7. НЕОБРАТИМЫМИ ИНГИБИТОРАМИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ ЯВЛЯЮТСЯ
а) полиароматические углеводороды б) соли тяжелых металлов в) фосфорорганические соединения г) алкилирующие агенты д) окислители
8.ОТРИЦАТЕЛЬНУЮ АЛЛОСТЕРИЧЕСКУЮ РЕГУЛЯЦИЮ КОНЕЧНЫМ ПРОДУКТОМ (ПО ТИПУ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ) МОЖНО РАССМАТРИВАТЬ КАК
а) конкурентное обратимое ингибирование б) конкурентное необратимое ингибирование
в) неконкурентное необратимое ингибирование г) неконкурентное обратимое ингибирование
9.ПРИ ПОДОЗРЕНИИ НА ОСТРОЕ ОТРАВЛЕНИЕ ФОС ОПРЕДЕЛЯЮТ АКТИВНОСТЬ
а) сукцинатдегидрогеназы б) эритроцитарной ЛДГ
в) сывороточной и эритроцитарной холинэстеразы г) эритроцитарной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы д) глюкозо-6-фосфатазы печени
ВЫБЕРИТЕ ВСЕ ПРАВИЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ
10. ВИДАМИ БЫСТРОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ЯВЛЯЮТСЯ
а) индукция синтеза фермента б) ковалентная модификация фермента в) репрессия синтеза фермента г) аллостерическая регуляция
д) образование множественных форм
11. ОБРАТИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТА ВОЗНИКАЕТ, ЕСЛИ
а) фермент и ингибитор связаны ковалентно б) фермент и ингибитор связаны ионной связью
в) фермент и ингибитор связаны водородной связью г) между ферментом и ингибитором гидрофобное взаимодействие
83
12.ВИДАМИ МЕДЛЕННОЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ЯВЛЯЮТСЯ
а) индукция синтеза фермента б) ковалентная модификация в) репрессия синтеза фермента г) аллостерическая регуляция
д) образование множественных форм
13. НЕКОНКУРЕНТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОИСХОДИТ, ЕСЛИ
а) субстрат и ингибитор схожи по структуре б) субстрат и ингибитор не схожи по структуре
в) ингибитор связывается в активном центре фермента г) ингибитор не связывается в активном центре фермента
14.АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МОЖНО ОПРЕДЕЛИТЬ СЛЕДУЮЩИМИ МЕТОДАМИ
а) спектрофотометрическими б) полярографическими в) титрометрическими г) потенциометрическими д) нефелометрическими
15. КОНКУРЕНТНОЕ ОБРАТИМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ВОЗНИКАЕТ, ЕСЛИ
а) субстрат и ингибитор имеют разное строение б) субстрат и ингибитор имеют подобное строение
в) ингибитор присоединяется нековалентными связями г) ингибитор присоединяется ковалентными связями д) избыток субстрата вытесняет ингибитор е) избыток субстрата не вытесняет ингибитор
16.ПРИ ПОДОЗРЕНИИ НА ОТРАВЛЕНИЕ ТИОЛОВЫМИ ЯДАМИ ОПРЕДЕЛЯЮТ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ
а) эритроцитарной ХЭ б) эритроцитарной ЛДГ в) сывороточной ХЭ
г) эритроцитарной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы д) глюкозо-6-фосфатазы печени
17. КОФЕРМЕНТАМИ ДЕГИДРОГЕНАЗ ЯВЛЯЮТСЯ
а) ФП б) коэнзим А
в) ФАД г) НАД+
84
д) ТДФ е) НАДФ+
18. ТИОЛОВЫМИ ЯДАМИ ЯВЛЯЮТСЯ
а) полиароматические углеводороды б) соли тяжелых металлов в) фосфорорганические соединения г) алкилирующие агенты д) окислители
19.НИЗКАЯ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТОЧНОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ НАБЛЮДАЕТСЯ ПРИ
а) отравлении гидразином б) хроническом отравлении ФОС
в) синдроме гепатоцеллюлярной недостаточности г) остром отравлении фосфорорганическими соединениями д) отравлении этиленгликолем
20. ПРОТЕКТОРАМИ В СЛУЧАЕ ДЕЙСТВИЯ ТИОЛОВЫХ ЯДОВ ЯВЛЯЮТСЯ
а) цистин г) дигидролипоевая кислота ЛК < SH SH
|
|
|
S |
||
б) цистеин |
д) амид липоевой кислоты ЛК < |
|
|
||
|
|||||
|
|
|
S |
||
в) глутатион |
е) унитиол |
||||
|
|
УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ |
|||
21. ВИД ИНГИБИРОВАНИЯ |
ИНГИБИТОР СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ |
||||
1) |
обратимое |
|
А) хлористый кадмий |
||
2) |
необратимое |
|
Б) йодацетат |
||
|
|
|
В) перекись водорода или другой окислитель |
||
|
|
|
Г) малонат |
||
|
|
|
Д) оксалоацетат |
||
22. ВИД ИНГИБИРОВАНИЯ |
ИНГИБИТОР АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ |
||||
1) |
обратимое |
|
А) карбофос |
||
2) |
необратимое |
|
Б) зарин |
||
|
|
|
В) прозерин |
||
Г) витамин B1 Д) дихлофос
85
23. ФЕРМЕНТ, НА КОТОРЫЙ ОН |
ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ |
|
ДЕЙСТВУЕТ |
|
|
1) |
циклооксигеназа (ЦОГ) |
А) контрикал |
2) |
фосфолипаза А2 |
Б) диакарб |
3) |
ГМГ КоА-редуктаза |
В) аспирин |
4) |
карбоангидраза почечных |
Г) симвастатин |
|
канальцев |
Д) ибупрофен |
5) |
протеолитические ферменты |
Е) преднизолон |
УСТАНОВИТЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
24.ЭТАПЫ БЫСТРОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФЕРМЕНТОВ
(1)– присоединение эффектора в аллостерический центр фермента
(2)– изменение конформации активного центра
(3)– повышение активности фермента
(4)– образование молекулы эффектора
(5)– изменение конформации фермента
25.ЭТАПЫ АКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТОВ ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ
(1)– повышение активности фермента
(2)– присоединение металла к молекуле фермента
(3)– выгодное изменение конформации активного центра
(4)– повышение внутриклеточной концентрации ионов металлов
(5)– изменение конформации молекулы фермента
26.ЭТАПЫ АКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТОВ ОГРАНИЧЕННЫМ ПРОТЕОЛИЗОМ
(1)– появление функционального центра
(2)– отщепление короткого пептида от молекулы профермента
(3)– синтез профермента
(4)– появление активности фермента
(5)– изменение конформации фермента
ДОПОЛНИТЕ
27.Дегидрогеназы по строению активного центра относятся к
_____________ ____________.
28.Холинэстеразы по строению активного центра относятся к
___________ _____________.
29.Определяют активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы эритроцитов при подозрении на отравление
__________ ядами.
30.Определяют активность сывороточной и эритроцитарной холинэстераз при подозрении на отравление _____________ ____________.
86
|
|
ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ |
1: |
а |
16: б, г |
2: |
в |
17: в, г, д, е |
3: |
в |
18: б, г, д |
4: |
г |
19: б, в, г |
5: |
в |
20: б, в, г, е |
6: |
г |
21: 1–Г; 2–А, Б, В |
7: |
в |
22: 1–В, Г; 2–А, Б, Д |
8: |
г |
23: 1–В, Д; 2–Е; 3–Г; 4–Б; 5–А |
9: |
в |
24: 4, 1, 5, 2, 3 |
10: |
б, г |
25: 4, 2, 5, 3, 1 |
11: |
б, в, г |
26: 3, 2, 5, 1, 4 |
12: |
а, в |
27: тиоловым ферментам |
13: |
б, г |
28: сериновым ферментам |
14: |
а, б, в, г |
29: тиоловыми |
15: |
б, в, д |
30: фосфорорганическими соединениями |
87
Тема 7. БЕЛКИ И ФЕРМЕНТЫ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ И БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ. ЭНЗИМОТЕРАПИЯ
Место проведения: кафедра биохимии. Продолжительность –
180 мин.
Цель занятия: углубить знания в области практического использования ферментов и белков в медицине, научиться анализировать и интерпретировать результаты биохимических анализов пациентов.
Конкретные задачи.
Студент должен знать:
–строение и биологическую роль ферментов;
–значение ферментного и изоферментного спектров в диагностике заболеваний;
–энзимотерапию;
–механизмы ингибирования ферментов;
–белки крови, их биологическую роль и использование для диагностики.
Студент должен уметь:
–анализировать, обобщать и излагать литературные данные;
–оценивать и интерпретировать данные биохимических лабораторных исследований (активности ферментов и протеинограммы) с целью использования их в диагностике различных заболеваний.
Студент должен владеть:
–информацией об изменениях биохимических показателей с учетом знания механизмов развития патологии при действии вредных факторов окружающей среды;
–навыками изложения самостоятельной точки зрения, анализа и логического мышления, публичной речи, ведения дискуссий и круглых столов;
–навыками интерпретации изменений биохимических показателей;
–навыками анализировать результаты лабораторных исследований;
–навыками анализа биохимических показателей в биологических жидкостях для постановки диагноза;
–компьютерной техникой и методами поиска необходимой информации.
88
Мотивация. Знания, полученные на занятии, необходимы врачу лечебного профиля в практической диагностической работе. Для мотивации предлагаются ситуационные задачи на базе результатов биохимических анализов пациентов клиник.
Изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-5) и профессиональных (ПК-9, ПК-15 ПК-16, ПК-17, ПК18, ПК-31, ПК-32) компетенций.
Пример входного контроля – см. Тестовые задания.
Вопросы для самоподготовки
1.Белки плазмы крови, их роль в организме.
2.Разделение белковых фракций крови методом электрофореза.
3.Характеристика отдельных фракций белков крови (альбумины, глобулиновые фракции). Роль в организме. Причины изменения содержания в крови.
4.Белки острой фазы.
5.Транспортные белки крови (альбумин, церулоплазмин, гаптоглобин, трансферрин, гемопексин).
6.Характерные изменения протеинограмм при различных заболева-
ниях.
7.Понятие об индикаторных, секреторных и экскреторных ферментах сыворотки крови, использование их в диагностике заболеваний.
8.Изоферменты. Их диагностическое значение.
9.Энзимотерапия.
10.Иммобилизованные ферменты.
11.Ингибиторы ферментов. Виды ингибирования.
12.Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов.
Задание для самоподготовки: изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.
Рекомендуемая литература
Основная
Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :
ГЭОТАР-МЕД, 2004. – С. 102–108, 118–123, 682–683; То же. – 2011. – С. 101– 107, 118–123, 669–673.
Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :
Медицина, 1998. – С. 163–168, 567–574, 577–580.
89
Белки и ферменты : учебно-методическое пособие к практическим заняти-
ям по биологической химии / под ред. проф. В.А. Дадали, доц. Р.Н. Павловой. – СПб. : Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013.
СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ
Задача 1. О каких заболеваниях может идти речь при наличии следующих ферментных спектров крови:
1)АЛТ АСТ ГлДГ КФК амилаза
2)КФК АСТ АЛТ амилаза ГлДГ
3)Амилаза АЛТ АСТ ГлДГ КФК
Что такое «индикаторные ферменты плазмы крови»? Почему спектры, характеризующие разные заболевания, имеют сходный состав, но различную последовательность ферментов в указанных рядах?
Литература Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :
Медицина, 1998. – С. 320, 435, 439, 579–580.
Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :
ГЭОТАР-МЕД, 2011. – С. 101–107, 118–123, 301, 460–463.
Задача 2. Больной А. жалуется на резкую опоясывающую боль в подложечной области. При исследовании ферментов крови оказалось, что активность амилазы равна 35 мг/(с ∙ л), липазы – 1600 нмоль/(с ∙ л).
Больной Б. предъявляет те же жалобы, но активность амилазы в крови равна 2,3 мг/(с ∙ л), а липазы – 0 нмоль/(с ∙ л).
О патологии какого органа можно подумать в этих случаях? Чем объяснить различия в изменении активности амилазы и липазы крови у данных больных?
Литература Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :
Медицина, 1998. – С. 238–239, 286–287, 320, 366, 446–447, 579–580.
Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :
ГЭОТАР-МЕД, 2011. – С. 118–123, 301, 374.
Задача 3. Охарактеризуйте изоферментные спектры лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), креатинфосфокиназы (КФК) различных органов и тканей. Какое значение имеет определение изоферментных спектров крови для дифференциальной диагностики заболеваний различных органов?
90