2 курс / Биохимия / Обмен белков и ферменты

Перемешать, выдержать 15 мин при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность опытной (Dоп) и калибровочной (Dк) проб против контрольной пробы (табл. 2). Светофильтр 550 (540–570) нм. Концентрацию белка в пробе рассчитать по формуле:

С = Dоп/Dк ∙ 70,

где 70 – концентрация белка в калибровочной пробе (г/л).

Вывод: __________________________________________.

Клинико-диагностическое значение определения белка в плазме крови

Всыворотке крови здорового человека содержится 65–85 г/л белка.

Вплазме крови за счет фибриногена белка – на 2–4 г больше. Это – нормопротеинемия. Изменения общего белка не являются специфическими, а отражают общий патологический процесс (воспаление, некроз, новообразования), динамику и тяжесть заболевания. Пониженная концентрация белка в крови – гипопротеинемия, повышенная – гиперпротеинемия. Изменения концентрации общего белка плазмы крови могут носить относительный и абсолютный характер. Так, нагрузка водой, гидремия, приводит к относительной гипопротеинемии.

Наиболее частые причины гипопротеинемии:

1. Недостаточное потребление белка с пищей и несбалансированный аминокислотный состав пищи (голодание, ограничение приема пищи у курильщиков, алкоголиков).

2. Нарушение переваривания и всасывания белковых компонентов пищи при хронических воспалительных заболеваниях желудочнокишечного тракта (диспепсия, дизентерия, гастроэнтериты).

3. Понижение биосинтеза белка в печени (альбумина, фибриногена, части глобулинов) (хронические и острые гепатиты, циррозы, длительные воспалительные процессы и тяжелые тиреотоксикозы).

4. Врожденное отсутствие или недостаточное содержание какоголибо белка в плазме крови.

21

5.Потери белка при острых и хронических кровопотерях (кровотечениях).

6.Выделение белка (альбумина) с мочой при нефрозе и амилоидозе. Содержание белка при этом может снижаться до 25–30 г/л. Врожденный нефротический синдром проявляется протеинурией и отеками.

7.Понижение содержания белка в крови у женщин в период лактации и в последние месяцы беременности.

При уменьшении содержания белка в плазме крови возникают гипопротеинемические отеки вследствие снижения онкотического давления и задержки воды в тканях.

Абсолютная гиперпротеинемия – явление редкое. Стойкая гиперпротеинемия (до 120 г/л и более) отмечается при миеломной болезни (белки Бенс-Джонса) и при макроглобулинемии Вальденштрема в связи

свозникновением патологических очагов синтеза белков. Незначительная гиперпротеинемия встречается при некоторых хронических воспалительных заболеваниях (хронический полиартрит).

Построение калибровочного графика для определения белка по методу Лоури

1.Готовят стандартный раствор белка с концентрацией 1 мг/мл. Для приготовления стандартного раствора используют альбумин бычий, лиофилизированный.

2.Из стандартного раствора готовят путем разбавления серию рабочих растворов (обычно 5–7) с известной концентрацией белка

(табл. 3).

Готовят не менее 3 параллельных проб для каждой концентрации белка.

22

3.В подготовленные растворы (1–7), а также контрольную пробу (0), содержащую 1 мл физиологического раствора, добавляют по 2 мл щелочного реактива, а затем после перемешивания 0,2 мл реактива Фо- лина–Чиокальтео. Пробы снова перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

4.Колориметрируют на фотоэлектроколориметре в кюветах с рабо-

чим расстоянием 1 см с красным светофильтром ( =610 нм) против контрольной пробы.

5. Полученные растворы используют для построения калибровочного графика зависимости оптической плотности (D) от концентрации белка в растворе (С): D = f(C).

Метод дает хорошие результаты при соблюдении закона Бугера– Ламберта–Бера.

Основные понятия фотоколориметрии

Фотоколориметрия – один из самых распространенных методов исследования в биохимии и медицине. Основан на измерении поглощения света окрашенным веществом в видимой области спектра от 400 до 800 нм. Метод может быть использован для определения концентрации окрашенного вещества в растворе путем измерения поглощения света при одной или нескольких длинах волн, а также для определения активности ферментов, если субстраты или продукты ферментативной реакции могут быть окрашены с помощью реагентов и поглощать свет в видимой области спектра.

В основе количественных фотоколориметрических методов исследования лежит закон светопоглощения Бугера–Ламберта–Бера: интенсивность монохроматического светового потока, прошедшего через слой раствора поглощающего вещества, ослабляется по экспоненциальному закону:

I = I0 ∙10– k∙C∙l,

где I – интенсивность светового потока, прошедшего через слой окрашенного раствора; I0 – интенсивность падающего светового потока; k – коэффициент светопоглощения; С – концентрация вещества; l – толщина слоя раствора.

Более удобна логарифмическая форма закона: оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества и толщине слоя раствора:

23

D = ∙ C ∙ l,

где D – оптическая плотность раствора, характеризует поглощение света веществом, D = lgI0/I; C – молярная концентрация раствора, моль/л; l – толщина слоя раствора, численно равная рабочему расстоянию кюветы, см; – молярный коэффициент светопоглощения вещества для определенной длины волны света, или молярная экстинкция. Она равна оптической плотности 1М раствора, помещенного в кювету с толщиной слоя 1 см (при С = 1 моль/л и I = 1 см, D = ), является для данного вещества величиной постоянной. Может быть определена по справочнику или, чаще, определяется экспериментальным путем.

Кроме оптической плотности (D) на практике часто используется величина светопропускания (Т), характеризующая способность окрашенного раствора пропускать световой поток: Т = I/I0, или T(%) = (I ∙ 100 %)/I0 (обозначения см. выше). Оптическая плотность и величина светопропускания связаны между собой логарифмической зависимостью: D = lg(1/T).

Отклонения от закона Бугера–Ламберта–Бера могут быть обусловлены присутствием посторонних примесей в растворе, процессами электролитической диссоциации, гидратации, гидролиза и другими причинами.

Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметра

Микроколориметр медицинский фотоэлектрический (МКМФ-1) предназначен для измерения коэффициентов пропускания или оптической плотности окрашенных растворов при биохимическом анализе с целью количественного определения различных компонентов биологических растворов.

Диапазон измерений коэффициента пропускания от 5 до 100 %, значений оптических плотностей от 0 до 1,3.

Рабочий спектральный диапазон 420–650 нм обеспечивается светофильтрами. Для выбора светофильтров используют 2 пробы исследуемого вещества различной концентрации и измеряют их оптические плотности с различными светофильтрами. Светофильтр, при котором разность оптических плотностей двух исследуемых проб максимальна, обеспечивает наибольшую чувствительность метода. Выбранный светофильтр пропускает лишь тот диапазон длин волн, который максимально поглощается исследуемым веществом (табл. 4).

24

Микроколориметр работает от сети переменного тока с частотой 50 Гц и номинальным напряжением 220 В. Время установления рабочего режима микроколориметра после включения не превышает 1 ч.

Микроколориметр измеряет оптическую плотность (D) или коэффициент пропускания (T, %) исследуемого раствора относительно контрольного раствора. В качестве контрольного раствора используется кювета с дистиллированной водой или контрольным раствором, оптическая плотность которой принимается равной нулю (коэффициент пропускания 100 %).

На пути светового пучка поочередно устанавливают контрольный и исследуемый растворы.

Световой поток от лампы накаливания, проходя через оптическую систему и исследуемый раствор в кювете, попадает на светочувствительный слой вакуумного фотоэлемента, который является элементом отсчетно-измерительной схемы. В зависимости от значения коэффициента пропускания исследуемого раствора изменяется световой поток, прошедший через раствор и падающий на фотоэлемент. При этом изменяется ток фотоэлемента, а следовательно и электрический сигнал, подаваемый на микроамперметр.

Концентрация раствора определяется при помощи калибровочного графика зависимости оптической плотности раствора от его концентрации (по таблице, составленной по данным такого графика) или путем сравнения с эталонным раствором с известной концентрацией вещества.

На лицевой панели прибора расположены следующие компоненты управления и сигнализации:

25

–микроамперметр с двумя шкалами – шкалой коэффициентов пропускания (Т, %) и шкалой оптических плотностей (D);

–диод светоизлучающий, сигнализирующий о наличии напряжения питания;

–переключатель «Сеть» для включения микроколориметра;

–ручка переменного резистора «Установка нуля»;

–ручка переменного резистора «Установка 100 % Т». Непосредственно перед лицевой панелью, на горизонтальной плос-

кости съемной крышки, находятся:

–гнездо для установки рабочих светофильтров;

–кюветное отделение и гнездо для установки контрольных светофильтров, закрывающихся светозащитной крышкой.

Под съемной крышкой укреплена в патроне лампа накаливания – источник света, элементы оптической схемы, а также преобразователь.

На задней панели прибора расположены вставки плавкие, шнур питания, оканчивающийся вилкой штепсельной двухполюсной с заземляющим контактом, гнездо для подключения микропроцессора.

Оптическая схема микроколориметра

Световой поток от источника 1 собирается линзовым конденсором 2, который дает изображение нити источника в центре кюветы. На пути луча устанавливается светофильтр 3. В кюветном отделении устанавливается сменная кювета 4. После кюветы свет падает на светочувствительный слой фотоэлемента 5. Перед фотоэлементом может быть установлена заглушка для перекрытия светового потока.

Подготовка к работе

1.Присоедините микроколориметр к электросети при помощи сетевого шнура с вилкой двухполюсной и заземляющим контактом.

2.Установите в гнездо для рабочих светофильтров фильтр, соответствующий методике измерения биологической пробы.

3.Осмотрите рабочую поверхность кюветы. На ней не должно быть видимых глазом грязных пятен, ворсинок и пыли. Наполните кювету дистиллированной водой или контрольным раствором.

26

4.Установите кювету в кюветное отделение.

5.В гнездо для установки заглушки поместите заглушку, предохраняющую фотоэлемент.

6.Закройте крышку кюветного отделения.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

ВЫБЕРИТЕ ВСЕ ПРАВИЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ

1. АМИНОКИСЛОТЫ, ИМЕЮЩИЕ ЗАРЯЖЕННЫЕ РАДИКАЛЫ

а) Ала б) Сер в) Фен г) Глу д) Лиз

2. АМИНОКИСЛОТЫ, ИМЕЮЩИЕ ГИДРОФОБНЫЕ РАДИКАЛЫ

3. УНИВЕРСАЛЬНЫЕ ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ

а) реакция Сакагучи б) нингидриновая реакция

в) ксантопротеиновая реакция г) реакция Фоля д) биуретовая реакция

4. КАЖДАЯ БЕЛКОВАЯ МОЛЕКУЛА ИМЕЕТ

а) третичную структуру б) первичную структуру в) четвертичную структуру г) вторичную структуру д) небелковые компоненты

5. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА МОЖЕТ ПРЕДСТАВЛЯТЬ СОБОЙ

6.ФАКТОРЫ, МЕШАЮЩИЕ ОБРАЗОВАНИЮ АЛЬФА-СПИРАЛИ, – ЭТО РЯДОМ РАСПОЛОЖЕННЫЕ

а) несколько гидрофобных радикалов

27

б) два и более разноименно заряженных радикала в) два и более одноименно заряженных радикала г) пролин и оксипролин д) гидрофильные и гидрофобные радикалы

7. СВЯЗИ, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ ТРЕТИЧНУЮ СТРУКТУРУ БЕЛКА

а) водородные связи б) сложноэфирные связи в) гидрофобные связи г) ионные связи д) дисульфидные связи е) пептидная

8. СВЯЗИ, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ ЧЕТВЕРТИЧНУЮ СТРУКТУРУ БЕЛКА

9. ПРИЧИНЫ ГИПОПРОТЕИНЕМИИ

а) недостаточное потребление белка с пищей б) снижение синтеза белка в печени в) избыточное потребление белка с пищей

г) возникновение патологических очагов синтеза белков д) нарушение переваривания и всасывания белков

УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ

следовательность В) мутации в этих участках приводят к

изменению биологической роли белка

28

ДОПОЛНИТЕ

14.Первичная структура белка – это линейная структура, состоящая из

__________ и стабилизированная ___________ связями.

15.Эффект кооперативности определяет ________ структура белка.

29

Тема 3. ПРОТЕОМИКА. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. АНАЛИЗ БЕЛКОВОГО СОСТАВА СЫВОРОТКИ КРОВИ

Место проведения: кафедра биохимии. Продолжительность изучения темы – 180 мин.

Необходимое оснащение: таблицы по электрофорезу, приборы для электрофореза на ацетатцеллюлозных мембранах и в полиакриламидном геле (в качестве демонстрации).

Мотивация. Знания, полученные на занятии, необходимы для понимания некоторых механизмов действия различных природных и техногенных факторов среды на белковые молекулы, их роли в развитии болезней, понимания причин профессиональных заболеваний, методов асептики и антисептики, умения оценивать результаты биохимического исследования.

Изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-5) и профессиональных (ПК-9, ПК-15, ПК-18, ПК-33) компетенций.

Цель занятия: систематизация и углубление знаний о биохимических механизмах действия факторов внешней среды на белки, их практическое использование в асептике и антисептике, о белковом составе сыворотки крови.

Конкретные задачи.

Студент должен знать:

–характеристику белков по растворимости;

–тип и свойства белковых растворов;

–диализ как метод очистки белковых растворов;

–факторы и механизмы высаливания;

–факторы и механизмы денатурации;

–практическое применение высаливающих и денатурирующих факторов;

–факторы, влияющие на заряд белка;

–методы разделения белков, их принципы;

–белки плазмы крови.

Студент должен уметь:

–проводить очищение раствора белка методом диализа;

–проводить разделение белков методом фракционного высаливания;

–выбирать метод разделения белков с учетом цели разделения;

30