2 курс / Биохимия / Обмен белков и ферменты

лью выявления признаков действия на организм вредных факторов среды, для изучения патогенеза заболеваний, оценки эффективности способов их профилактики и лечения. Например, в клинике определяют активность двух трансаминаз – аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ). Повышение активности АЛТ наблюдается при заболеваниях печени, сопровождающихся цитолизом гепатоцитов, а повышение активности АСТ – при патологии сердечной мыщцы, сопровождающейся цитолизом кардиомиоцитов. Поэтому метод может быть широко использован при диагностике гепатитов, изучении действия гепатотропных ядов, для диагностики инфаркта миокарда.

Реактивы: 1) сыворотка крови – источник фермента аланинаминотрансферазы; 2) субстратная смесь, содержащая аланин и α-кетоглу- тарат; 3) раствор гидроксида калия –10 % (вещество, меняющее рН среды); 4) раствор хлорида кадмия 1 % (ионы тяжелого металла); 5) 2,4- динитрофенилгидразин – 0,5 % раствор; 6) 0,4 н. раствор гидроксида натрия.

Принцип метода. Аминотрансферазы или трансаминазы катализируют межмолекулярный перенос аминогруппы с аминокислот на кетокислоты. Коферментом трансаминаз является фосфопиридоксаль, который служит непосредственным переносчиком аминогрупп. Определение концентрации кетокислот, образующихся в процессе трансаминирования из аминокислот, составляет основу методов количественного определения трансаминазной активности и проводится путем спектрофотометрических или фотоколориметрических измерений. Количество образующейся в данной реакции пировиноградной кислоты определяют по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином, в ходе которой развивается красно-бурое окрашивание в щелочной среде.

Аланинаминотрансфераза (К. Ф. 2.6.1.2) катализирует реакцию переаминирования между L-аланином и α-кетоглутаровой кислотой:

61

Влияние неспецифических факторов на активность ферментов

Ход работы. В 4 пробирки наливают по 0,05 мл сыворотки крови, содержащей фермент аланинаминотрансферазу. В первую пробирку добавляют 0,5 мл воды и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин, во вторую – добавляют 0,5 мл 10 % раствора КОН, в третью – 0,5 мл 1 % СdСl2, в четвертую – 0,5 мл физиологического раствора, эту пробирку используют для определения активности нативного фермента, в пятую – 0,5 мл воды, в эту пробирку сыворотку крови не добавляют, она служит контролем на реактивы. Через 5 мин во все пробирки добавляют по 0,5 мл раствора субстратной смеси и выдерживают их в термостате при 38° С 20 мин. После этого во все пробирки добавляют по 0,2 мл 2,4-динитрофенилгидразина, встряхивают и оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре, затем во все пробирки добавляют по 2,5 мл 0,4 н. раствора гидроксида натрия, встряхивают и колориметрируют против пробы 5 в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм с зеленым светофильтром ( =560 нм) после 10 мин инкубации при комнатной температуре. Активность фермента определяют по калибровочному графику (табл. 10).

62

Вывод: _____________________________________________.

Специфичность действия ферментов

Проявляется в их способности катализировать строго определенные реакции. В данной работе специфичность действия аланинаминотрансферазы исследуют путем инкубации ее с 2 субстратами: D-аланином и L-аланином (ферменты организма специфичны к L-аминокислотам). Работу выполняют по следующей схеме (табл. 11).

Таблица 11

Результаты эксперимента по изучению специфичности действия АЛТ

После 20 мин инкубации в термостате во все пробирки добавляют по 0,20 мл 2,4-динитрофенилгидразина, встряхивают и оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре, затем во все пробирки добавляют по 2,5 мл 0,4 н. раствора гидроксида натрия, встряхивают и колориметрируют против контроля в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм с зеленым светофильтром ( =560 нм) после 10 мин инкубации при комнатной температуре. Активность фермента определяют по калибровочному графику.

Вывод: _______________________________________

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

ВЫБЕРИТЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ОТВЕТ

1.ЧАСТЬ СЛОЖНОГО ФЕРМЕНТА, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ ЕГО СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ПРЕДСТАВЛЕНА

а) белком б) коферментом

в) кофактором

63

г) простетической группой д) небелковой частью

2. КАЖДЫЙ ФЕРМЕНТ ИМЕЕТ

а) кофермент б) кофактор

в) активный центр г) аллостерический центр

д) простетическую группу

3. ВСЕ ФЕРМЕНТЫ ДЕЛЯТСЯ НА КЛАССЫ НА ОСНОВЕ

а) типа катализируемой реакции б) химической природы фермента в) химической природы субстрата г) химической природы продукта д) условий протекания реакции

4. КОНСТАНТА МИХАЭЛИСА (Km) ОПРЕДЕЛЯЕТ

а) сродство фермента к данному субстрату б) сродство фермента к продукту реакции в) начальную скорость реакции г) максимальную скорость реакции д) тип специфичности

5. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ ЗАКЛЮЧАЕТСЯ В ТОМ, ЧТО

а) ферменты повышают величину энергетического барьера б) ферменты снижают величину энергетического барьера в) ферменты повышают величину энергии активации г) ферменты снижают величину энергии активации д) ферменты снижают температуру реакции

6.ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФЕРМЕНТОВ СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ

а) уменьшается б) увеличивается значительно

в) остается неизменной г) равна нулю

д) увеличивается незначительно

7. УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА–МЕНТЕН ОТРАЖАЕТ

а) зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

б) концентрацию субстрата, при которой наступает равновесие реакции

64

в) концентрацию фермента, при которой наступает равновесие реакции

г) максимальную скорость ферментативной реакции д) минимальную скорость ферментативной реакции

8.ТЕМПЕРАТУРНЫЙ ОПТИМУМ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ СООТВЕТСТВУЕТ

а) минимальной скорости реакции б) максимальной скорости реакции

в) максимальной концентрации субстрата г) минимальной концентрации субстрата д) максимальной концентрации продукта

ВЫБЕРИТЕ ВСЕ ПРАВИЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ

9. АКТИВНЫЙ ЦЕНТР ФЕРМЕНТА – ЭТО

а) участок фермента, непосредственно взаимодействующий с субстратом и участвующий в катализе

б) центр, имеющий комплементарность к субстрату в) центр, составляющий относительно небольшую часть молекулы

фермента г) центр, имеющий только полярные аминокислоты

д) центр, имеющий комплементарность к продукту

10. ТИПЫ СВЯЗИ СУБСТРАТА С АКТИВНЫМ ЦЕНТРОМ ФЕРМЕНТА

а) гидрофобные б) водородные в) ионные г) ковалентные

д) макроэргические

11.КОНФОРМАЦИОННАЯ ЛАБИЛЬНОСТЬ СТРУКТУРЫ ФЕРМЕНТОВ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ

а) превращением субстрата в области активного центра б) специфичностью связывания субстрата в активном центре в) выходом продуктов из области активного центра

г) кооперативным взаимодействием субъединиц в олигомерном белке д) сдвигом электронной плотности в фермент-субстратном комплексе

12. В СОСТАВ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ФЕРМЕНТА ВХОДЯТ

а) только полярные радикалы аминокислот б) небелковая часть фермента в) каталитический участок г) зона связывания

65

д) зона регуляции

13.ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ОТ рН ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМИ ФАКТОРАМИ

а) окислением функциональных групп б) денатурацией фермента при очень высоких или очень низких зна-

чениях рН в) разрушение гидрофобных или водородных связей

г) восстановление функциональных групп д) изменением величины заряда молекул субстрата или фермента

УСТАНОВИТЕ СООТВЕТСТВИЕ

14. КОФЕРМЕНТ ФЕРМЕНТ

4)аминоацил-т-РНК- Е) лигазы (синтетазы) синтетаза

66

67

23.Небелковая часть сложного фермента, которая представлена органической молекулой (производным витамина), называется

_______________.

24.Небелковая часть сложного фермента, которая представлена ионом металла, называется ___________.

25.Сложный фермент называется _______________.

26.Белковая часть сложного фермента называется ________________.

27.Небелковая часть сложного фермента, которая представлена органической молекулой и прочно связана с белковой частью, называет-

ся ________________ _________.

28.Дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию, называется

_______________ _____________.

29.Концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, называется ___________ ______________.

30.Механизм ферментативного катализа включает формирование

__________-_____________ _____________.

68

69

Тема 6. АКТИВАЦИЯ И ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ, СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Место проведения: кафедра биохимии. Продолжительность занятия –180 мин.

Цель занятия: систематизировать знания по механизмам действия активаторов и ингибиторов. Освоить методы определения активности ферментов, используемых в энзимологии. Разобрать принципы определения активности холинэстеразы, сукцинатдегидрогеназы, влияние на их активность ингибиторов и активаторов. Освоить методу определения активности сывороточной холинэстеразы исукцинатдегидрогеназы мозга.

Конкретные задачи.

Студент должен знать:

–виды и механизмы активации ферментов;

–виды и механизм действия ингибиторов ферментов. Студент должен уметь:

–пользоваться фотоэлектроколориметром;

–количественно определять колориметрическим методом активность сывороточной холинэстеразы;

–оценивать действие активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Студент должен владеть информацией об изменениях биохимических показателей с учетом знания механизмов развития патологии при действии вредных факторов окружающей среды.

Мотивация. Изучаемая тема обеспечивает приобретение навыков в проведении контроля состояния здоровья лиц, связанных с производством и использованием алкилфосфатов, фосфорорганических соединений (ФОС), окислителей, тяжелых металлов, алкилирующих агентов, для выявления признаков и оценки тяжести острого и хронического отравления этими веществами (например, у лиц, связанных с производством, транспортом и хранением их), для контроля патогенетической терапии интоксикаций.

Изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-5) и профессиональных (ПК-2, ПК-8, ПК-9, ПК-15) компетенций.

70