2 курс / Биохимия / Обмен белков и ферменты

Задание для самоподготовки: изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.

Рекомендуемая литература

Основная

Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :

Медицина, 1998. – С. 114–168, 637–641.

Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :

ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 102–118; То же. – 2011. – С. 100–118.

Белки и ферменты : учебно-методическое пособие к практическим заняти-

ям по биологической химии / под ред. проф. В.А. Дадали, доц. Р.Н. Павловой. – СПб. : Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013.

Дополнительная

Марри, Р. Биохимия человека ; т. 1 / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Ро-

дуэлл. – М. : Мир, 1993. – С. 63–110.

Вопросы для самоподготовки

1.Какие существуют виды ингибирования ферментов?

2.Что такое обратимое ингибирование ферментов? Привести при-

мер.

3.Что такое необратимое ингибирование ферментов? Приведите пример.

4.Что такое конкурентное ингибирование ферментов? Приведите пример.

5.Что такое неконкурентное ингибирование ферментов? Приведите пример.

6.Какие вещества и почему являются ингибиторами дегидрогеназ?

7.Что такое тиоловые ферменты, особенности их активного центра? Приведите пример тиоловых ферментов.

8.Что такое «тиоловые яды», какие вещества к ним относятся и как они влияют на активность ферментов?

9.Какие биохимические функции выполняют холинэстеразы?

10.Какие вещества являются ингибиторами холинэстераз (обратимые и необратимые), механизмы их действия?

11.Какие существуют виды активации ферментов?

12.Что такое металлофермент?

13.Как происходит активация ферментов ионами металлов?

14.Как происходит активация ферментов ограниченным протеоли-

зом?

71

15.Каков механизм действия протекторов? Обоснуйте выбор протекторов для тиоловых ферментов.

16.Какой принцип лежит в основе определения активности фер-

мента?

17.Какими методами можно определить активность фермента?

18.Какие единицы активности ферментов вы знаете? Дайте определение каждой из них.

19.Регуляция активности ферментов.

20.Быстрая регуляция активности ферментов, ее виды.

21.Как осуществляется медленная регуляция активности фермен-

тов?

Пример входного контроля – см. Тестовые задания.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы. Изучение ингибирующего действия карбофоса и активирующего действия ионов кальция

Различают два типа холинэстераз (ХЭ): ацетилхолинэстеразу (АХЭ, истинная ХЭ, К. Ф. 3.1.1.7) и бутирилхолинэстеразу (сывороточная ХЭ, псевдохолинэстераза, К. Ф. 3.1.1.8). Ферменты являются простыми белками, относятся к классу гидролаз и подклассу эстераз.

Ацетилхолинэстераза – фермент, катализирующий расщепление ацетилхолина на одноатомный азотсодержащий спирт холин и уксусную кислоту, содержится в мозге, печени, почках, мышцах, эритроцитах и других тканях. Ацетилхолин участвует в передаче нервных импульсов в качестве химического медиатора в синапсах центральной и периферической нервной системы, выделяясь в синаптическую щель в момент проведения импульса. Его ферментативное расщепление необходимо для подготовки постсинаптической мембраны к проведению следующего нервного импульса. Ацетилхолинэстераза нервной ткани связана с наружной стороной постсинаптической мембраны, состоит из однородных глюкопротеиновых субъединиц, чаще из четырех. Система «ацетилхолин–холинэстераза» участвует в регуляции возбудимости и сократимости гладкой и сердечной мышц, в осуществлении процессов активного и пассивного переноса ионов через мембраны.

Псевдохолинэстераза в основном содержится в печени, поджелудочной железе, слизистой оболочке кишечника, легких и сыворотке.

72

Возможно, что постоянное присутствие чрезвычайно активной ХЭ в плазме крови является защитным приспособлением и предотвращает распространение по тканям ацетилхолина при его попадании в кровяное русло.

Показано, что в небольших количествах ХЭ содержится и в центральной нервной системе. Существует предположение, что роль ХЭ нервной системы сводится к защите АХЭ от угнетающего действия таких эфиров холина, которые практически не разрушаются АХЭ, но могут образоваться в организме (пропионилхолин, бутирилхолин, валерилхолин и др.), а ХЭ их разрушает. Возможно также, что в отдельных участках мозга могут создаваться ненормально высокие концентрации ацетилхолина, избыток которого, как известно, тормозит АХЭ, но не влияет на активность ХЭ, которая его разрушает.

На активность фермента могут влиять специфические факторы: ингибиторы и активаторы. К специфическим необратимым ингибиторам ацетилхолинэстеразы относятся эфиры фосфорной кислоты: алкилфосфаты, фосфонаты, которые применяются в качестве инсектицидов, боевые отравляющие вещества – зарин, заман, табун, а также некоторые фармакологические препараты – армин, фосфакол, хлорофтальм. Обратимые ингибиторы – тетраалкиламмониевые соли: физостигмин, прозерин, эдрофоний. Активируют ацетилхолинэстеразу ионы кальция и магния.

По данным А.А. Покровского (1961), существует более 100 вариантов методов химического определения холинэстеразной активности в крови, в большинстве своем основанных на определении скорости образования уксусной кислоты (то есть одного из продуктов реакции) и различающихся по способам этого определения. Методы делятся на манометрические, титриметрические, колориметрические и спектрофотометрические. Существует экспресс-метод определения активности ХЭ в сыворотке крови с использованием хроматографической бумаги, пропитанной ацетилхолином и индикатором, изменяющим окраску в зависимости от рН среды.

Цель работы: освоить метод определения активности холинэстеразы; изучить действие на активность холинэстеразы ингибиторов и активаторов.

Принцип метода: основан на смещении рН буферного раствора уксусной кислотой, образующейся в результате гидролитического ферментативного расщепления ацетилхолина, что устанавливают с помощью индикатора.

73

Схема реакции:

Реактивы и оборудование: 1) боратный буфер, рН 8,4; 2) ацетилхолинхлорид 3 % раствор; 3) индикатор фенолрот; 4) кальций хлорид – 0,1 н. раствор; 5) карбофос – 1 % раствор; 6) дистиллированная вода; 7) термостат 37° С; 8) пробирки и пипетки для реактивов; 9) фотоэлектроколориметр.

Ход работы. В 4 пробирки отмеривают по 0,1 мл сыворотки крови (источник фермента), добавляют по 1 мл боратного буферного раствора рН 8,4. 3атем в соответствии с таблицей в пробирки добавляют дистиллированную воду, СаС12 и карбофос, перемешивают содержимое пробирок встряхиванием и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Через 5 мин в пробирки № 2, 3, 4 добавляют по 0,5 мл ацетилхолина и помещают все пробы в термостат при 37° С на 1 ч.

Таблица 12

Ход работы по изучению влияния карбофоса и ионов кальция на активность сывороточной холинэстеразы

74

После инкубации в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл дистиллированной воды и по 50 мкл раствора индикатора. Затем пробы колориметрируют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром ( =540 нм) в кюветах с толщиной слоя жидкости 10 мм, в качестве контроля используют дистиллированную воду.

Результаты измерений вносят в табл. 13. Из показателей оптической плотности стандартной (1) пробы вычитают значения оптической плотности опытной (2, 3, 4). Рассчитывают активность ХЭ по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют разведения 0,1 н. уксусной кислоты с ее содержанием в пробе от 4 до 18 мкмоль в пробе, что соответствует активности ХЭ от 80 до

360 ммоль/(л∙ч).

Активность ХЭ в сыворотке в норме составляет 160–340 ммоль/(л∙ч).

Вывод: ___________________________________________.

Клиническое значение определения активности сывороточной ХЭ

Активность ХЭ в группе здоровых лиц колеблется в широких пределах, но у одного и того же человека она довольно постоянна. Отчетливое снижение активности ХЭ в сыворотке крови отмечается при заболеваниях печени, гипотиреозе, бронхиальной астме, суставном ревматизме, инфаркте миокарда, ожогах, травматическом шоке, раке, в послеоперационном периоде. Поскольку активность сывороточной холинэстеразы (бутирилхолинэстеразы) отражает белковосинтетическую функцию печени, ее определение может проводиться с целью выявления действия гепатотропных ядов.

Метод может быть использован для контроля состояния здоровья лиц, связанных с получением и использованием алкилфосфатов, фосфонатов и других фосфорорганических соединений (ФОС); для выявления признаков и оценки тяжести острого и хронического отравления ФОС (например, у лиц, связанных с производством, использованием, транспортом и хранением инсектицидов), для контроля эффективности патогенетической терапии интоксикаций. Угнетение активности ХЭ в сыворотке крови наступает при низких дозах яда и выявляется значительно раньше других симптомов интоксикации.

Количественное определение активности тканевых дегидрогеназ и изучение действия их ингибиторов

Непосредственным источником энергии, необходимой для процессов жизнедеятельности, являются химические вещества: глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты и другие органические соединения.

75

Внутримолекулярная энергия этих веществ освобождается при их окислении, которое в биологических условиях происходит путем дегидрирования и катализируется субстратспецифичными ферментами – дегидрогеназами, относящимися к классу оксидоредуктаз. Коферменты дегидрогеназ – никотинамид и флавин, содержащие нуклеотиды (НАД, НАДФ, ФАД), выполняют функции акцепторов водорода, отщепляемого при окислении субстрата. Определение концентрации восстановленных акцепторов составляет основу многих методов количественного определения дегидрогеназной активности и проводится путем спектрофотометрических или фотоколориметрических измерений.

Дегидрогеназы относятся к числу так называемых «тиоловых» ферментов, каталитическое действие которых обусловлено сульфгидрильными (тиоловыми) группами, входящими в состав активного центра молекул фермента или ответственными за поддержание каталитически активной конформации. Поэтому ингибиторами дегидрогеназ являются вещества, блокирующие SH-группы, к ним относятся окисляющие, меркаптидобразующие алкилирующие вещества, такие, например, как перекись водорода (окислитель), хлорид кадмия и другие тяжелые металлы (Hg, Pb, Ag, Cu – меркаптидобразующий агент), йодуксусная кислота (алкилирующий агент). Ингибирование протекает по уравнению реакций:

б) Белок – S – Cd – Cl + Белок – SH Белок – S – Cd–S – Белок + НСl.

3. Белок – SH + IСН2СООН Белок – S – СН2СООН + HI.

Применение метода в санитарно-гигиенических исследованиях

Метод определения активности дегидрогеназ может быть использован в гигиенических исследованиях при производственных и пищевых отравлениях окислителями, солями тяжелых металлов, алкилирующими агентами. Активность дегидрогеназ определяется при экспериментальных и клинических исследованиях, направленных соответственно либо на изучение биохимических механизмов действия на организм химических и физических факторов среды (ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, шум, вибрация), либо на выявление признаков интоксикаций и других заболеваний.

76

Количественное определение активности дегидрогеназы янтарной кислоты (сукцинатдегидрогеназы, К. Ф. 1.3.99.1)

тетразолиевым методом

Цель работы: освоить метод количественного определения сукцинатдегидрогеназы. Исследовать действие ингибиторов на ее активность (УИРС).

Принцип метода. В результате окисления янтарной кислоты образуется фумаровая кислота и восстановленный ФАД.

COOH COOH

CH2 ФАД ФАД 2H CH

сукцинатдегидрогеназа

CH2 CH

COOH COOH

Водород, отщепляемый от субстрата дегидрогеназой, восстанавливает бесцветную соль тетразолия в яркоокрашенное соединение формазан.

Активность фермента характеризуется величиной оптической плотности раствора формазана, эквивалентного количеству отщепленного от субстрата водорода ферментом (ФАД·2Н) за 1 с в расчете на 1 г ткани, то есть катал на 1 г ткани.

Данные анализа и выводы: _________________________________.

Определение общей активности лактатдегидрогеназы (К. Ф. 1.1.1.27) и ее изоферментов

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза) – гликолитический (цитозольный цинкосодержащий) фермент (молекулярная масса 135 000 Д), обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Окисленный никотинадениндинуклеотид используется в качестве кофермента и является акцептором водорода.

Схема реакции:

CH3CHOHCOOН + HAД+ CH3COCOOН + HAДH ∙ H+

лактатдегидрогеназа

77

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных изоферментов, обладающих одинаковыми каталитическими свойствами. Каждый из изоферментов представляет собой тетрамер, образованный субъединицами Н (heart) и М (muscle). Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков; различия в их последовательности в субъединицах обнаружены на протяжении более чем 25 % длины полипептидной цепи. Свойства ферментов ЛДГ определяются особенностями входящих в них субъединиц. Изменения в строении белковой части изоферментов обусловливают их различные физико-химические свойства (в частности, неодинаковую электрофоретическую подвижность). В плазме (сыворотке) крови выявлено пять изоферментов лактатдегидрогеназы: ЛДГ1

(HHHH) – 14–26 %, ЛДГ2 (НННМ) – 29–39 %, ЛДГ3 (ННММ) – 20–26 %, ЛДГ4 (НМММ) – 8–16 %, ЛДГ5 (ММММ) – 6–16 %. Они рас-

полагаются в геле в порядке убывания электрофоретической подвижности.

Субъединица М обнаруживается главным образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как субъединица Н присутствует в тканях с преобладанием аэробных процессов. Изофермент ЛДГ1 осуществляет окисление лактата в пируват в тканях с аэробным типом метаболизма (миокард, мозг, почки, эритроциты, тромбоциты), а ЛДГ5, напротив, пирувата в лактат в тканях с высоким уровнем гликолиза (скелетные мышцы, печень).

Шестой изофермент лактатдегидрогеназы (ЛДГ-Х) встречается в яичках взрослых особей наряду с пятью изоферментами, которые обнаруживаются в других тканях. ЛДГ-Х является тетрамером, состоящим из 4 идентичных Х-субъединиц, которые отличаются по аминокислотному составу от Н- и М-субъединиц. Этот изофермент, видимо, связан со сперматогенезом, так как 80 % активности лактатдегидрогеназы сперматозоидов обусловлено этим изоферментом.

Методы определения общей активности ЛДГ подразделяются на две основные группы:

1) кинетические, базирующиеся на оптическом тесте Bapбypга (оптическом эффекте, связанном с превращением НАД+ в НАД ∙ Н+, и наоборот);

78

2) методы, в которых определяется количество образовавшегося продукта или потребляемого субстрата после фиксированного инкубационного периода (методы конечной точки).

Для изучения изоферментного спектра лактатдегидрогеназы используются способы, базирующиеся на:

–фракционировании методом зонального электрофореза или хроматографии (изоферменты ЛДГ нумеруются соответственно электрофоретической подвижности по отношению к аноду) с последующим тетразольным окрашиванием фракций и денситометрическим учетом картины разделения;

–дифференцированном неселективном и селективном ингибировании изоферментов ЛДГ: пируватом (ЛДГ1 более чувствительна к его влиянию, чем ЛДГ5), лактатом, оксалатом (более ингибирует ЛДГ1, чем ЛДГ5), мочевиной (инактивирует ЛДГ5);

–различии в тепловой стабильности изоферментов ЛДГ;

–применении антител (к ЛДГ1 и ЛДГ5): иммунохимические тесты и некоторые другие.

Клиническое значение определения активности лактатдегидрогеназы

В связи с тем, что фермент ЛДГ содержится практически во всех тканях, констатация повышения общей активности лактатдегидрогеназы не имеет большого значения для дифференциальной диагностики заболеваний внутренних органов.

Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает у больных, страдающих анемией, обширным карциноматозом, опухолями, лейкозами, лимфомой, вирусным и невирусным гепатитом, обтурационной желтухой, циррозом печени, различными заболеваниями почек, опорнодвигательного аппарата, инфарктом миокарда и легкого, а также при любом другом повреждении клеток, приводящем к цитолизу и утрате цитоплазмы (этот фермент, широко представленный в тканях организма, легко переходит в плазму крови при некробиотических процессах в клетках).

Относительная активность изоферментов ЛДГ4 и ЛДГ5 повышена у всех больных инфекционным гепатитом в первые 10 сут. Характерно, что степень повышения не зависит от тяжести заболевания. После наступления клинического выздоровления у трети пациентов увеличение относительной активности ЛДГ4 и ЛДГ5 является единственным пока-

79

зателем, свидетельствующим о незаконченном восстановительном процессе в печени.

У больных инфарктом миокарда активность фермента в сыворотке крови повышается через 8–10 ч после начала приступа, достигает максимума через 24–28 ч, остается увеличенной на протяжении первой недели заболевания, нормализуясь к 8–9-м суткам. Ценность данного теста особенно велика в неясных случаях заболевания, при нетипичной клинической и электрокардиографической картине инфаркта миокарда.

К увеличению общей активности ЛДГ приводит прием алкоголя, кофеина, введение анаболических стероидов, тестостерона, обезболивающих препаратов, дикумарина, хинидина, сульфаниламидов, кодеина, клофибрата, мисклерона, гипоксическое состояние.

Существуют две группы причин, обусловливающих снижение активности фермента в крови и тканях. Одна из них связана с наличием ингибитора в сыворотке (плазме) крови, вторая – с генетическими нарушениями.

Рекомендуемая литература

Камышников, В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В.С. Камышников. – М. : МЕДпресс-информ, 2004.

Методы определения активности ферментов

По способу измерения скорости ферментативной реакции различают:

1.Измерение по конечной точке. При этом определяют содержание продуктов реакции в инкубационной среде после фиксированного времени инкубации и остановки ферментативной реакции.

2.Кинетическое измерение с непрерывным (многоточечным) измерением абсорбции в ходе ферментативной реакции.

3.Двухточечное измерение. При этом способе выбирают линейный участок кривой, определяют абсорбцию дважды – в начале измерения и

вконце.

4.Измерение по начальной скорости, когда скорость реакции нелинейна и снижается во времени, так как возможна инактивация фермента во времени или продукты реакции влияют на ее скорость.

По технике исполнения методы определения активности ферментов зависят от химической природы субстрата или продукта.

80