4
ФЕРМЕНТЫ КАК СПЕЦИФИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ
Многие методы клинической лабораторной диагностики основаны на взаимодействии фермента, добавляемого извне, с определенными соединениями. В результате данного взаимодействия появляется специфический продукт реакции, содержание которого определяют и судят по нем о концентрации искомого вещества.
Глюкозооксидаза
??Глюкозооксидазный метод используется для количественного определения содержания глюкозы в плазме крови, моче, цельной крови и спинномозговой жидкости.
Глюкозооксидаза – FAD-содержащий специфический
фермент, используемый для количественного определения глюкозы в глюкозооксидазных биосенсорах.
Механизм действия:
1.ß-D-глюкоза окисляется под действием глюкозооксидазы до ß-D-глюконолактона и при этом выделяется эквимолярное количество молекул Н2О2.
2.Сначала протоны водорода Н+ переносятся с глюкозы на молекулы кофермента FAD, который восстанавливается до
FADH2
3.Затем протоны водорода переносятся на молекулу О2 с образованием H2O2 и окисленной формы FAD
4.Далее глюконолактон спонтанно гидролизуется до глюконовой кислоты, а H2O2 под действием пероксидазы окисляет субстрат-хромоген в окрашенный продукт реакции.
Интерпретация результатов: по степени изменения окраски судят о количестве глюкозы в исследуемой жидкости. Степень изменения окраски обычно определяют при помощи спекрофотометра.
5
Механизм действия современных глюкометров:
1.ß-D-глюкоза окисляется под действием глюкозооксидазы до ß-D-глюконолактона.
2.В процессе реакции электроны с ß-D-глюкозы переносятся сначала на кофермент FAD, который при этом восстановливается до FADH2
3.Затем электроны с FADH2 переносятся на металл, из которого состоят электроды тест-полосок глюкометра.
4.На электродах глюкометра образуется электрический ток, величина которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в крови.
6
Лактатоксидаза
Зачем нам определять концентрацию молочной кислоты (лактата) в крови?
Концентрацию лактата (молочной кислоты) в крови определяют для оценки тяжести шока, гипоксических состояний и сахарного диабета. Тяжесть вышеперечисленных состояний прямо пропорциональна концентрации молочной кислоты в крови.
Механизм действия:
1.Под действием лактатоксидазы происходит окисление молочной кислоты до пировиноградной кислоты с выделением эквимолярного количества молекул H2O2.
2.Далее H2O2 в присутствии фермента пероксидазы реагирует с N-этил-N- (2-гидрокси-3-сульфопропил)-3-метиланилином с образованием окрашенного соединения, интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации лактата в пробе.
Рекстриктазы бактерий
Рестриктазы бактерий (специфические эндонуклеазы) используются для исследования генома, например, в пренатальном скрининге наследственных заболеваний.
7
Taq-полимераза
Термистабильная taq-полимеразы используется для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая необходима для:
•диагностики наследственных и инфекционных заболеваний
•определения степени родства
•судебной медицины.
Иммуноферментный анализ
Метод иммуноферментного анализа основан на реакции антиген-антитело. При этом для проведения реакции используются антитела, меченые ферментом. Таким образом, происходит образование тройного комплекса «искомый антиген-антитело-фермент». При этом искомое вещество не является субстратом фермента, но является антигеном.
Если в среде присутствует искомый антиген, то с ним соединяется антитело, меченное ферментом, а затем мы можем измерить активность фермента различными способами, которая будет прямо пропорциональна концентрации фермента и соответственно концентрации антигена.
Чаще всего используют фермент пероксидазу хрена, которая при добавлении к ней субстрата-хромогена изменяет его окраску. По степени изменения окраски можно судить об активности фермента и соответственно
оналичии антигена.
Вкачестве субстратов-хромогенов чаще всего применяют:
•3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин (TMB)
•3,3'-Диаминобензидин (DAB)
•Хемилюминесцентный люминол