2 курс / Биохимия / Клиническая_биохимия_Арипов_А_Н_,_Фесенко_Л_М_2000

Коэффициент перевода мг/10 мл в мкмоль/л 17,1, обратно — 0,0584.

Примечания. Некоторые авторы рекомендуют щелочной вариант,

унифицированный ВОЗ после развития окраски (перед этапом колориметрирования) добавлять в пробы по 3 капли 30% NaOH; цвет раствора при этом изменяется на зеленый, часто наблюдается исчезновение мутности. Пробы с полученной окраской следует колориметрировать при красном светофильтре.

В случае большой концентрации билирубина сыворотку следует развести физиологическим раствором в 2 раза.

Диагностическая значимость. Повышение при повреждении печеночных клеток (воспалительного, токсического и неопластического происхождения), закупорке желчных протоков, гемолитических заболеваниях, физиологической желтухе новорожденных, болезни Жильбера, нарушении толерантности к глюкозе.

5.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (МИКРОМЕТОД)

При выявлении гипербилирубинемий у новорожденных можно применять микрометод в модификации Т.Б. Доброседовой и А.С.Циркиной.

Количество сыворотки, необходимое для определения общего, связанного и свободного билирубина, составляет 0, 4 мл. Сыворотку разводят равным объемом физиологического раствора.

Колориметрию и расчет производят также, как э^о рекомендуется в унифицированном методе определения; поскольку сыворотки взято в опыт 0,125 мл, полученный результат умножают на 4 (с учетом разведения).

Примечание. Реактивы готовят так же, как и в унифицированном

методе Йендрашек, Клеггорн, Гроф.

Дальнейшее определение проводят по схеме:

165

Построение калибровочной кривой для определения билирубина сыворотки крови (м-д Шеллонг и Венде, 1960)

Реактивы для построения калибровочной кривой. 1. 15 мл свежей негемолизированной сыворотки практически здорового человека (или смесь сывороток здоровых доноров).

2. Основной стандартный раствор билирубина.

В колбе емкостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30—35 мл 0,1 М раствора углекислого натрия (10,6 г безводного Na,C03 доводят до 1 л дистиллированной водой)). Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков. Доводят до метки 0,1 М раствором Na2C03 и перемешивают. Полученный раствор (80 мг%) стоек в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина.

3. Рабочий раствор билирубина.

К 7 мл свежей негемолизированной сыворотки добавляют 1 мл свежеприготовленного 80 мг% (1368 мкмоль/л) раствора билирубина и 0,05 мл (1 каплю) 4 н раствора уксусной кислоты (22,6 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в холодильнике не более суток. Этот раствор содержит точно на 10 мг% билирубина больше, чем его находится в сыворотке крови, взятой для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке , при стандартизации пользуются соответствующей компенсационной жидкостью.

Компенсационная жидкость. Для ее приготовления смешивают 7 мл той же сыворотки, которую используют для приготовления рабочего раствора стандарта билирубина, 1 мл 0,1 М раствора Ыа2С03и 0,05 мл (1 каплю) 4 н раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочной кривой обычно используют 5—6 разведений с различным содержанием билирубина (табл. 5.1).

166

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Таблица 5.1

Данные для построения калибровочной кривой по методу Шеллонг и

Венде.

Стандартные пробы (0,5 мл) обрабатывают параллельно, по вышеописанному унифицированному методу, причем пробы одинаковой концентрации исследуются 4—5 раз; из данных всех определений выводят среднее значение экстинции для рабочего раствора билирубина какойлибо одной концентрации.

При построении калибровочного графика к каждой пробе добавляют по 1,75 мл кофеинового реактива, так как в качестве стандарта используют свободный били

167

рубин. Контролем служит компенсационная жидкость, из которой готовят разведения аналогично стандартным пробам, т.е. берут 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 мл ее и доводят физиологическим раствором объем до 0,5 мл. Далее их обрабатывают, как опытные (или стандартные) пробы.

Калибровочную кривую строят, откладывая на оси ординат разность оптических плотностей опытных и контрольных проб, а на оси абсцисс — соответствующие концентрации билирубина (ммоль/л).

2. Построение калибровочного графика удобно производить с помощью наборов «Билирубин-эталон», выпускаемых фирмой «Лахема». Набор содержит лиофилизированный билирубин, альбумин и инструкцию по построению графика.

5.3.ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В МОЧЕ

Внорме моча содержит незначительное количество билирубина, которое не улавливается обычными качественными пробами. В моче присутствует только прямой билирубин, так как непрямой не проходит через здоровый почечный фильтр. Исключение составляют новорожденные, у которых в моче определяется и непрямой билирубин.

Вклинической практике получили распространение качественные пробы на билирубин, в основе которых лежит реакция окисления его в биливердин, имеющий изум- рудно-зеленую окраску.

Проба Розина. Наиболее доступна и проста. К 2—3 мл мочи добавляют путем осторожного наслаивания 0,5—1 мл спиртового раствора 1 % йода или люголевского раствора (1 г йода и 1 г калия йодистого на 50 мл дистиллированной воды). При наличии билирубина на границе между обеими жидкостями образуется зеленое кольцо. Проба также положительна при наличии крови в моче и после приема антипирина.

Проба Гмелина. В качестве окислителя используют концентрированную азотную кислоту. На 1 мл мочи наслаивают 1 мл кислоты. Образующееся на границе с жидкостями изумрудно-зеленоватое кольцо указывает на положительную реакцию.

Проба Уотсона — Хавкинсона. Является наиболее чувствительной для определения билирубина в моче. Ленту фильтровальной бумаги, предварительно пропитанную концентрированным раствором хлористого бария и подсушенную, погружают в мочу на 1/4 — 1 минуту, вновь высушивают и капают на нее не более 1 — 2 капель реактива Фуше (25 г трихлоруксусной кислоты + 10 мл 10% хлорного железа + 100 мл дистиллированной воды). При положительной пробе появляется зеленая окраска.

Клиническое значение. Билирубинурия встречается, главным образом,

при паренхиматозной и механической желтухах. При гемолитической желтухе билирубинурии не наблюдается. Это позволяет использовать ее как дифференциально-диагностический признак. Однако, билирубинурия появляется только в случае тяжелого поражения печени, а в начальных стадиях не встречается. При физиологических желтухах новорожденных реакция на билирубин в моче становится положительной с хлороформной или эфирной вытяжкой мочи, тдк как билирубин в моче этих детей находится в нерастворимом состоянии (непрямой билирубин).

Уробилиногеновые тела — являются производными билирубина. В настоящее время различают уробилиногенные фракций:

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

уробилиноген, стеркобилиноген, а- уробилиноген и третий уробилиноген.

Определение в моче уробилиногена (уробилина). Бесцветный уробилиноген в выделенной моче под действием света превращается в желтый уробилин.

Проба Нейбауэра. В основе ее лежит цветная реакция конденсации уробилиногенных тел при взаимодействии с реактивом Эрлиха (2 г парадиметиламинобензальдегида + 98 мл 20% соляной кислоты). К 2 — 3 мл мочи добавляют 2—3 капли реактива Эрлиха. Окрашивание жидкости в красный цвет не позднее, чем в течение 30 секунд указывает на положительную реакцию, т.е. повышенное содержание уробилиногенных тел. Присутствие билирубина в моче может маскировать реакцию, поэтому его устраняют прибавлением 1 мл 10% раствора хлористого кальция или хлористого бария и нескольких капель аммиака до ясно щелочной реакции. Смесь отфильтровывают и ставят реакцию с фильтратом. Оценке реакции мешает присутствие в моче индола, скатола, индикана и некоторых лекарственных веществ: сульфаниламидов, парааминосалициловой кислоты. При приеме пищи, богатой хлорофиллом, в моче появляется филоэритриноген, дающий также положительную реакцию.

Проба Шлезингера на уробилин. К 2 — 3 мл мочи, уже стоявшей несколько часов, прибавляют равный объем 10% спиртового раствора уксусно-кислого цинка в 96% спирте и фильтруют. Образовавшиеся цинкуробилиновые комплексы остаются в

фильтрате и обуславливают зеленую флюоресценцию раствора, видимую на темном фоне. Наиболее отчетливо она обнаруживается при наблюдении в ультрафиолетовом свете.

Клиническое значение. В норме с мочой выделяется незначительное количество уробилиногена (0 — 2 мг за сутки у детей и 0,6 мг — у взрослых), обнаруживаемое специальными пробами. Моча новорожденных уробилиногена не содержит в связи с недостатком в кишечнике восстанавливающих бактерий.

Уробилиногенурия является постоянным симптомом при циррозе печени. При острой желтой атрофии печени уробилиногенурия появляется в начале заболевания, затем по мере развития его уменьшается и, наконец, исчезает, что связано с постепенной потерей билирубиновыделительной функции печенью. Появление уробилиногенурии при острой желтой атрофии печени свидетельствует об улучшении печеночной функции.

Характерные изменения в выделении уробилиногена в течение вирусного гепатита хорошо отражают динамику заболевания. Проба положительна еще в преджелтушный период. Наивысшей степени выраженности уробилиногенурия достигает в первые дни после появления желтухи, затем постепенно убывает и исчезает в самый разгар заболевания, что объясняется внутрипеченочным застоем желчи, и становится положительной вновь при выздоровлении. Продолжительная уробилиногенурия является плохим признаком. При обтурационной желтухе пробы на уробилиноген положительны лишь в далеко зашедших стадиях, когда имеются значительные повреждения паренхимы печени. Физиологическая желтуха нбворожденных протекает без уробилиногенурии. У детей положительная реакция на уробилиноген нередко наблюдается при кишечных заболеваниях (энтероколиты, кишечная непроходимость, продолжительные запоры), что

связано с повышенной реабсорбцией стеркобилиногена слизистой

169

Реактивы. 1. Трансформирующий раствор: ацетон-ци- ангидрин —0,5 мл, калий железосинеродистый —200 мг, натрий двууглекислый (бикарбонат натрия) —1 г, дистиллированная вода — до 1 л.

2. Калибровочный раствор гемиглобинцианида. В качестве калибровочного раствора могут применяться стандартные растворы гемиглобинцианида производства фирмы «И му на», «Ренал». Концентрация стандартного раствора гемиглобинцианида фирмы «Ренал» составляет 59,75 мг/%, «Имуна» -61,23 мг%. Стандартные растворы хранят в холодильнике при температуре +4°С в защищенном от света месте. Применяют в неразбавленном виде.

Исследуемый материал. Цельная кровь. (ЭДТА). Проба стабильна 48 часов при 4°С, 24 ч а с а п р и 23°С.

Ход определения.

Ощлтная проба: 0,02 мл крови приливают к 5 мл трансформирующего раствора (разведение в 251 раз), хорошо перемешивают, оставляют стоять на 10 минут, после чего измеряют на гемоглобинометре или спектрофотометре при длине волны 500—560 нм в кювете толщиной слоя 1 см против холостой пробы.

Холостая проба: трансформирующий раствор или вода.

Расчет. Производят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида, или по формуле:

дартнои пробы; С - концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе в мг%; К — коэффициент для пересчета мг% в г/л.

Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора готовят разведения, как указано в табл.5.2.

Таблица 5.2

Данные к построению калибровочного графика

Измеряют против холостой пробы.

174

Нормальные величины:

Влияющие факторы. Повышение отмечено при гипертриглицеридемии, при числе лейкоцитов >25* 109/ л, ложное повышение при наличии НЬС или HbS, прогрессирующих заболеваний печени. У курильщиков, вследствие образования функционально неактивного НЬСО показатели могут быть повышенными.

Диагностическая значимость. Содержание гемоглобина повышается при полицитемии, чрезмерных физических нагрузках, на больших высотах. Понижается при анемиях.

Примечания. 1. Концентрация НЬ несколько ниже между 17 и 7 часами

утра и после приема пищи. 2. Ложноположительные результаты могут отмечаться при гипогидратации, при ожогах, сильной рвоте, кишечной непроходимости или при длительном стазе при венепункции.

Г л а в а 6 СИСТЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

Система свертывания крови, или иначе система гемостаза, выполняет в организме жизненно важную функцию — поддерживает кровь в жидком состоянии внутри кровеносных сосудов и, вместе с тем, предупреждает и купирует кровотечение из поврежденных кровеносных

172

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

сосудов, является сложным ферментативным процессом, в котором принимает участие множество факторов, находящихся в плазме, тканях, кровяных элементах, главным образом, в тромбоцитах. Функциональными компонентами системы гемостаза являются: сосудистая стенка, тромбоциты ® другие клетки крови и определенные белки плазмы крови, ответственные как за свертывающий, так и за противосвертывающий процессы. Эта система находится в тейюй взаимосвязи с другими физиологическими системами организма. Регулируется центральной и периферической нервной системой, эндокринной системой, а также подвержена влиянию простагландинов, кининов и биогенных аминов (серотонин, гистамин и др.). Конечным продуктом реакций является фибрин, который служит основой тромба.

В зависимости от механизма остановки кровотечения принято различать два типа гемостаза: первичный — в котором принимают участие стенки сосудов, тромбоциты и отчасти эритроциты, и вторичный — когда в процесс включаются плазменные факторы коагуляции.

Первичный, микроциркуляторный или сосудистотромбоцитарный

гемостаз, обеспечивает остановку кровотечения из капилляров, мелких вен и артерий. Как следует из названия, в его реализации участвуют, главным образом, сосудистая стенка и тромбоциты. При травме кровеносного сосуда рефлекторно возникает его спазм в месте повреждения. В первые минуты это прекращает или, по крайней мере, значительно снижает кровопотерю. Сразу же вслед за сосудистым спазмом, происходит адгезия (прилипание) тромбоцитов к краям поврежденного сосуда и их агрегация (склеивание между собой). Освобождающиеся при этом из тромбоцитов АДФ (аденозиндифосфат), серотонин и адреналин усиливают сосудистый спазм и агрегацию тромбоцитов, а выделяющийся из поврежденных тканей и эндотелия сосудов тканевой тромбопластин взаимодействует с белковыми факторами плазмы (VII, IV, X, V,II) и образует некоторое количество тромбина. В результате агрегация тромбоцитов становится необратимой и формируется первичный, так называемый, белый тромбоцитарный тромб. На этом кровотечение из мелких кровеносных сосудов купируется.

При лабораторном обследовании больных, для характеристики реакций первичного гемостаза, используются тесты, отражающие, во-первых, состояние сосудистой стенки — это время кровотечения по Дуке, либо Айви. Во-вторых, исследуются тромбоциты — производится подсчет количества тромбоцитов в периферической крови и выполняются анализы их функциональной активности — пробы на адгезию и агрегацию тромбоцитов.

При кровотечениях из более крупных сосудов тромбоцитарного тромба недостаточно для остановки кровотечения. Под мощным давлением крови такой тромб выталкивается и поэтому автоматически подключается коагуляционный гемостаз.

Вторичный, макроциркуляторный, или коагуляционный гемостаз.

Обеспечивается собственно свертывающей системой крови, которая в норме состоит из двух взаимно уравновешенных звеньев — прокоагулянтного (свертывающего) и антикоагулянтного (противосвертывающего). Прокоагулянтная система базируется на 15 белковых плазменных факторах свертывания крови, 11 факторах тромбоцитов и факторах свертывания из других клеток крови и тканей. Главной функцией прокоагулянтного звена является образование фибринового сгустка.

Плазменные факторы сокращенно обозначаются римскими цифрами, а в

173