Реакция иммунофлуоресценции (прямая и непрямая). Механизм. Использование в диагностике. Примеры.
РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, сульфохлорид и др.), имеющими реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом.
Прямой метод РИФ основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом.
Непрямой метод РИФ - поэтапное выявление комплекса АГ-АТ с помощью флуоресцентных красителей:
1 этап - образование иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами.
2 этап - выявление этого комплекса путем обработки его меченым антигаммаглобулином.
РИФ применяется как метод ранней экспресс диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения РИФ используется люминесцентный микроскоп.
Иммуноферментный метод исследования. Принцип метода. Определение антигенов и антител с помощью ифа. Примеры.
Метод используется для выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, b-галактозой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую модификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА - один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.
ИФА применяют для:
1. диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней (ВИЧ, гепатит В и др);
2. определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях — 1010 — 1012 г/л.
3. В комплексной оценке иммунного статуса
Понятие об антигенах (определение). Строение. Свойства. Адъюванты. Антигенная структура бактериальной клетки. Практическое значение.
Антигены – вещества, способные нарушить генетическую индивидуальность организма, т.е. это вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации.
Имеют индивидуальное строение. Состоят из 2 частей:
1) Высокомолекулярный носитель (шлеппер-буксир) – высокополимерный белок, определяющий антигенность и иммуногенность антигена. Составляет 97-99% молекулы а/г.
2) Детерминантные группы (эпитопы) – олигосахариды или олигопептиды на поверхности молекулы. Определяет специфичность, а\г, индуцирует антигенный ответ и реагирует с а\т.
Свойства:
Чужеродность – это способность вещества нести на себе признаки генетического отличия. Все клетки организма человека маркированы белками МНС-системы (главный комплекс гистосовместимости). Эти поверхностные белки подразделяются на четыре группы НLA-антигенов. HLA-А,B,C есть на всех клетках человеческого организма, HLA-D – на поверхности иммуннокомпетентных клеток. Эта система обеспечивает разделение «свой-чужой» и используется, например, в трансплантологии.
Антигенность – это большая или меньшая способность вещества вызывать образование антител или сенсибилизацию лимфоцитов.
Специфичность – те особенности, которые позволяют антигену вступать во взаимодействие со строго определенными антителами или сенсибилизированными лимфоцитами. Все естественные белки обладают антигенной специфичностью, которая определяется аминокислотной последовательностью, вторичной и третичной структурой белковой молекулы. Но в наибольшей степени специфичность антигена определяется поверхностно расположенными аминокислотными остатками, называемыми антигенными детерминантами. На поверхности молекулы антигена обычно располагается несколько детерминантных групп, обладающих одинаковой или близкой специфичностью, что обуславливает поливалентность антигена. Детерминантная группа может быть отделена от белкового носителя, и тогда она не вызывает образования антител, но обладает способностью реагировать с ними.
Иммуногенность – способность вызывать состояние иммунологической памяти. Это понятие относится, главным образом, к микробным антигенам, обеспечивающим создание иммунитета (невосприимчивости) к инфекциям.
Адъюванты (лат. adjuvans – помогающий, способствующий) – вспомогательные факторы различного происхождения и различной химической природы, оказывающие неспецифическое стимулирующее действие на иммунный ответ при совместном их применении со специфическими антигенами или, другими словами, вещества, повышающие иммунный потенциал вакцин.
Каждый микроорганизм, как бы примитивно он ни был устроен, содержит несколько антигенов. Среди бактериальных антигенов различают: Н, О, K, Vi, протективный, экзотоксин.
Жгутиковые, Н-антигены, представляют собой белок флагеллин, входят в состав бактериальных жгутиков, термолабильны, разрушаются при температуре 56-60° С, но после обработки фенолом сохраняют свои антигенные свойства.
Соматические, О-антигены – располагаются в бактериальной клеточной стенке, термостабильны. Они сохраняются при кипячении более двух часов, не разрушаются после обработки спиртом и формалином. При иммунизации животных живыми культурами, имеющими жгутики, образуются антитела к О- и Н-антигенам, а при иммунизации кипяченой культурой образуются антитела только к О-антигену.
Капсульные, К-антигены – хорошо изучены у сальмонелл и эшерихий. Они тесно связаны с клеточной стенкой и капсулой. По отношению к температуре К-антигены делятся на А, В, L-фракции. А-фракция капсульного антигена термостабильна, выдерживает кипячение в течение двух часов. В-фракция выдерживает нагревание до 60° С в течение часа. L-фракция разрушается при нагревании до 60 °С.
К-антигены располагаются более поверхностно, чем O-антигены, и часто маскируют последние. Поэтому для выявления O-антигена необходимо предварительно разрушить К-антигены, что достигается кипячением культуры.
Поверхностный, Vi-антиген – антиген вирулентности у брюшнотифозных и некоторых других энтеробактерий, обладающих высокой вирулентностью. Он относительно термостабилен и представляет собой полисахарид.
Антигенные свойства бактериальных токсинов. Экзотоксины рассматриваются как внеклеточные антигены. Они обладают полноценными антигенными свойствами в том случае, если являются растворимыми соединениями белковой природы. Экзотоксины, обработанные формалином, утрачивают свои токсигенные свойства, но сохраняют антигенные функции. В данном случае они получили название анатоксинов.