Иллюстрационное пособие по общей микробиологии

331

Рисунок 10.35 – Патогенность для мышей капсульных пневмококков.

Бескапсульные пневмококки на питательном агаре образуют шероховатые колонии R-формы. При введении мышам бескапсульных клеток животные остаются живыми (рисунок 10.36).

Рисунок 10.36 – Патогенность для мышей бескапсульных пневмококков.

При кипячении бактериальной суспензии капсульные клетки погибают и при введении мышам гибели животных не отмечается (рисунок 10.37).

Рисунок 10.37 – Результат введения мышам убитых капсульных клеток.

Однако смесь убитых капсульных клеток и живых бескапсульных пневмококков вызывает гибель мышей. В этом случае из органов павших животных на питательном агаре высеваются капсульные пневмококки, образующие колонии S- формы (рисунок 10.38).

333

Этим экспериментом они установили, что изменение признаков происходит в результате поглощения бескапсульными клетками в организме животных ДНК капсульных клеток. Дальнейшее изучение этого явления показало, что к поглощению ДНК способны не все клетки, а только те, которые находятся в определенном физиологическом состоянии (состоянии компетентности). Состояние компетентности вызывает специальный низкомолекулярный белок (фактор компетентности), который бактерии синтезируют при определенных условиях выращивания. Максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце стадии логарифмического роста бактерий. Фактор компетентности способствует синтезу аутолизина, эндонуклеазы и ДНК-связывающего белка, которые обусловливают проникновение нуклеиновой кислоты в реципиентную клетку. Трансформирующая ДНК адсорбируется на ДНК-связывающем белке, затем проникает внутрь клетки и встраивается в гомологичный участок хромосомы реципиента.

В трансформации может участвовать как хромосомная, так и плазмидная ДНК. Хромосомные гены после проникновения в реципиентную клетку встраиваются в хромосому бактерии, а плазмидные гены либо интегрируют в хромосому реципиента, либо сохраняются в автономном состоянии (рисунок 10.40).

Трансформант

Рисунок 10.41 – Трансформация бактерий посредством хромосомной и плазмидной ДНК. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При трансформации реципиенту могут быть перенесены различные признаки (например, синтез ферментов, образование капсульного полисахарида, устойчивость к антибиотикам, в том числе множественная резистентность). Феномен трансформации воспроизводится в опытах с разными патогенными и непатогенными бактериями: бациллами, стрептококками, менингококками и др. Наиболее эффективно трансформация протекает у близкородственных бактерий (внутривидовая трансформация). Однако не исключена возможность и межвидовой трансформации (например, перенос ДНК от стафилококков к бациллам).

В 1946 г. американские генетики и биохимики Д. Ледерберг и Э. Тейтем (рисунок 10.41) описали другой способ переноса генетического материала от одной

334

бактерии в другую - конъюгацию (лат. conjugatio - соединение).

А Б

Рисунок 10.41 - А - Джошуа Ледерберг (Joshua Lederberg, 1925-2008 гг.), Б - Эдвард Тейтем (Edward Lawrie Tatum, 1909-1975 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Конъюгация - это передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент при их непосредственном контакте через конъюгационный мостик. Способность одной бактериальной клетки конъюгировать с другой связана с наличием F-плазмиды (англ. fertility - плодовитость). Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, не способны быть донорами, они обозначаются как F¯- клетки (женские клетки). Клетки, имеющие F-фактор, обозначаются как F+-клетки (мужские клетки). Перенос информации происходит в одном направлении: от F+- клетки к F¯-клетке. Конъюгационный мостик образуют половые ворсинки - sexпили, образование которых детерминируется F-плазмидой (рисунок 10.42).

Рисунок 10.42 – Конъюгационный мостик. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При контакте бактерий F+-клетки передают реципиенту F-плазмиду в виде цельной структуры, при этом F‾-клетки превращаются в F+-клетки и становятся способными к дальнейшей конъюгации. При наличии в клетках-донорах Hfrплазмид при конъюгации происходит одновременная передача в клетку-реципиент фрагмента бактериальной хромосомы.

Механизм конъюгации состоит в том, что F-плазмида кодирует эндонуклеазу, разрезающую одну из нитей плазмидной ДНК в определенной точке. Затем разрезанная цепь раскручивается и 5'-концом продвигается в клетку-

335

реципиент. В начале нити плазмидной ДНК, поступающей в реципиентную клетку, расположены гены, которые детерминируют синтез белков, препятствующих разрушению ДНК клеточными ферментами реципиента. В реципиентной клетке на основе поступившей нити ДНК восстанавливается двухнитевая структура плазмиды. Оставшаяся в клетке донора нить ДНК является матрицей для синтеза второй нити. Весь процесс длится несколько минут (рисунок

10.43).

Рисунок 10.43 – Процесс конъюгации. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Перенос с помощью F-плазмид хромосомных генов возможно только в случае интеграции плазмиды в бактериальную хромосому (Hfr+-клетки). В этом случае перенос ДНК начинается с разрыва одной из нитей ДНК в месте включения F-фактора. Затем одна цепь ДНК переносится в реципиентную клетку, а другая цепь остается в клетке-доноре. При таком переносе с высокой частотой передаются хромосомные гены, расположенные вблизи начала переноса. После переноса в клетке-реципиенте происходит гомологичная рекомбинация между привнесенной донорской ДНК и собственной ДНК реципиента.

В 1952 г. Джошуа Ледерберг и Нортон Циндер в опытах на сальмонеллах открыли еще один вид генетического обмена – трансдукцию. Трансдукция - это процесс передачи ДНК от клетки-донора в клетку-реципиент при участии бактериофагов. Трансдуцирующими свойствами обладают только умеренные фаги. Размножаясь в клетке-доноре, фаги включают в состав своего генома часть бактериальной ДНК. В дальнейшем, проникая в реципиентную клетку, они передают ей ДНК донора. Образующийся в результате трансдукции рекомбинант называется трансдуктантом (рисунок 10.44).

Хромосома

Фаг

Рисунок 10.44 – Процесс трансдукции. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

337

При трансдукции возможен перенос генов, контролирующих питательные потребности бактерий, их устойчивость к лекарственным препаратам и другие свойства. Приобретение бактериями новых свойств с помощью трансдуцирующих фагов называется лизогенией.

В 1958 г. Д. Ледерберг, Дж. Бидл и Э. Тейтем были удостоены Нобелевской премии за фундаментальные исследования организации генетического материала у бактерий.

При проведении генетических исследований используются и другие методы искусственного переноса ДНК в микробные клетки, в частности, слияние протопластов и электропорацию.

Слияние протопластов или сферопластов представляет собой механизм обмена генетической информацией при непосредственном контакте участков цитоплазматической мембраны бактерий. Для осуществления этого механизма вначале получают протопласты (сферопласты), а затем смешивают и индуцируют их слияние путем обработки полиэтиленгликолем или другими веществами (рисунок

10.47).

Рисунок 10.47 – Слияние протопластов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При слиянии протопластов (сферопластов) образуется клетка, объединяющая в себе геномы обоих родительских клеток. В последующем формируются стабильные рекомбинанты, совмещающие признаки родительских штаммов.

Электропорация представляет собой механизм внедрения ДНК в клетки путем создания пор в бислойной липидной мембране бактерий с помощью импульсов высокого электрического напряжения. При проведении электропорации через среду, содержащую микробные клетки и фрагменты ДНК, пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200-350 В) длительностью несколько десятков миллисекунд, в результате чего в цитоплазматической мембране образуются поры (электропробой), через которые в клетку из внешней среды проникает ДНК. Для осуществления электропорации используют специальные приборы, способные создать требуемые условия (рисунок 10.48).

338

Электроды

Переносимая ДНК

Рисунок 10.48 – Схема электропорации (а) и система Gene Pulser Xcell для электропорации прокариотов (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

10.3. Понятие о генной инженерии

Микроорганизмы широко используются в производстве антибиотиков, аминокислот, ферментов и других соединений. В качестве продуцентов применяют бактерии, селекционированные по уровню синтеза целевых продуктов. Для селекции продуцентов применяют как традиционные методы (отбор по продуктивности, искусственный мутагенез), так и генную инженерию.

Генная (генетическая) инженерия - это раздел молекулярной биологии, исследующий возможность создания лабораторным путем новых генетических структур и наследственно измененных организмов. Такие исследования обозначают также как технология рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование.

В последние годы все шире используется термин синтетическая биология. В основе генетической инженерии лежит целенаправленное манипулирование с фрагментами нуклеиновых кислот. В 1970 г. швейцарский микробиолог В. Арбер и американские микробиологи Д. Натанс и О.С. Хамилтон (рисунок 10.49) открыли рестрикционные ферменты.

Hamilton, родился в 1931 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

339

Учеными было установлено, что в бактериальных клетках синтезируются два вида ферментов. Одни из них (эндонуклеазы) расщепляют чужеродную ДНК, проникшую в клетку. Другие ферменты (метилазы) модифицируют проникшую ДНК, делая ее устойчивой к воздействию эндонуклеаз. Эти исследования привели к открытию широкого круга ферментов рестрикции, позволяющих разрезать молекулы ДНК на фрагменты в строго определенных участках. В 1978 г. В. Арбер, Д. Натанс и С. Хамилтон были удостоены Нобелевской премии в области медицины

ифизиологии.

В1972 г. американский биохимик П. Берг (рисунок 10.50) получил первую рекомбинантную молекулу ДНК на основе фага лямбда и галактозного оперона кишечной палочки.

Рисунок 10.50 – Пол Наим Берг (Paul Naim Berg, родился в 1926 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В 1973 г. английский биохимик Ф. Сенгер (рисунок 10.51) показал, что после ферментативного расщепления молекулы ДНК возможно реконструировать ее двухцепочечную структуру по шаблону одинарной цепи. Этот метод позволяет устанавливать нуклеотидную последовательность ДНК.

Рисунок 10.51 – Фредерик Сенгер (Frederick Sanger, родился в 1918 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В 1977 г. американские ученые У. Гилберт (рисунок 10.52) и А. Мексем разработали процедуру установления нуклеотидной последовательности ДНК – метод секвенирования.

340

Рисунок 10.52 – Уолтер Гилберт (Walter Gilbert, родился в 1932 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В1980 г. Ф. Сенгер, У. Гилберт и П. Берг были удостоены Нобелевской премии за фундаментальные исследования нуклеиновых кислот.

В1973 г. американские ученые С. Коэн и Г. Бойер (рисунок 10.53) в плазмиду одной бактерии встроили фрагмент плазмиды другой бактерии и показали возможность функционирования химерной (искусственно созданной) молекулы ДНК в клетках E. coli.

А Б

Рисунок 10.53 – А - Стэнли Коэн (Stanley Cohen, родился в 1935 г.), Б - Герберт Бойер (Herbert Boyer, родился в 1936 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

С тех пор генетически измененные (модифицированные) организмы получают либо путем введения нужного гена из генома одного организма в геном другого организма, либо путем встраивания в геном бактерии искусственно синтезированного гена. С помощью методов генетической инженерии возможно увеличить количество вырабатываемого микроорганизмами необходимого продукта (аминокислот, ферментов); осуществлять перенос генов млекопитающих в клетки микроорганизмов (бактерий, дрожжей) для получения гормонов, интерферонов, ферментов, иммуноглобулинов; генетически изменять соматические клетки человека, страдающего наследственными заболеваниями.

Для создания генетически измененных организмов подбирают вектор - молекулу ДНК, способную к самостоятельной репликации в клетке-реципиенте. Затем выделяют требуемый для клонирования ген, соединяют его с вектором и