Иллюстрационное пособие по общей микробиологии

211

К первичным клеточным культурам относятся культуры фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ), клетки почек человека (КПЧ) и др. (рисунок 6.37).

а б Рисунок 6.37 – Первичная культура клеток (а - культура мышиных фибробластов: б

–культура фибробластов человека).

3.Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40-50 пассажей. Их получают обычно из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей они сохраняют диплоидный набор хромосом и не претерпевают злокачественной трансформации. В частности, к полуперевиваемым культурам клеток относится культура легких эмбриона человека (рисунок 6.38)

Рисунок 6.38 – Полуперевиваемая культура легких эмбриона человека.

4. Перевиваемые (стабильные, пассажные) культуры клеток

выдерживают многочисленные пассажи и способны размножаться в лабораторных условиях десятки лет. Их получают преимущественно из опухолевых тканей. По сравнению с первичной культурой перевиваемая культура имеет продолжительный срок культивирования и высокую скорость размножения. К числу перевиваемых относятся культуры клеток карциномы шейки матки (HeLa), раковой опухоли гортани (HEp-2) и др. (рисунок 6.39).

Заражение культур клеток проводят следующим образом. Из сосудов с выросшим монослоем клеток удаляют остатки питательной среды, монослой отмывают раствором Хенкса и вносят вируссодержащий материал. Через 1-1,5 часа остатки вируссодержащего материала удаляют, вносят поддерживающую питательную среду и культуру инкубируют в термостате.

212

Рисунок 6.39 – Перевиваемая культура клеток HEp-2.

О репродукции вирусов в культуре клеток судят на основании следующих феноменов:

1. Цитопатическое действие (ЦПД) или цитопатический эффект (ЦПЭ) вирусов представляет собой патологические изменения морфологии клеток вплоть до их гибели в результате репродукции вирусов. Для обнаружения ЦПД культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа. ЦПД проявляется фрагментацией клеток (разрушение клеток на отдельные фрагменты), вакуолизацией цитоплазмы, разрушением митохондрий, образованием симпластов (формированием гигантских многоядерных клеток) и округлением клеток, то есть образованием шаровидных форм (рисунок 6.40).

а б Рисунок 6.40 – Проявление ЦПД: а – нормальные клетки; б – шаровидные формы.

2. Образование внутриклеточных включений. Включения могут локализоваться как в ядре (внутриядерные включения), так и в цитоплазме (цитоплазматические включения). Они представляют собой скопления вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов. Их выявляют с помощью светового или люминесцентного микроскопа после окрашивания зараженных клеток анилиновыми красителями или флюорохромами. Цитоплазматические включения формируются при натуральной оспе (тельца Гварниери), бешенстве (тельца БабешаНегри), а внутриядерные включения – при аденовирусной инфекции, герпесе

(рисунок 6.41).

213

а б Рисунок 6.41 – Цитоплазматические включения при оспе (а) и внутриядерные

включения при аденовирусной инфекции (б).

3. Образование бляшек (негативных колоний) под агаровым покрытием. Бляшки представляют собой участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Каждая бляшка формируется потомством одного вириона. Бляшки, образуемые разными вирусами, различаются по размеру, форме, срокам появления (рисунок 6.42).

Рисунок 6.42 – Бляшки на монослое клеточной культуры.

4. Реакция гемадсорбции. Гемадсорбция - способность культур инфицированных вирусом клеток адсорбировать на своей поверхности эритроциты

(рисунок 6.43).

Рисунок 6.43 – Реакция гемадсорбции.

5. Цветная реакция регистрируется по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде для культур клеток. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выделяют кислые продукты, изменяющие цвет индикатора. При репродукции

214

вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается, и клетки погибают, в результате чего среда сохраняет первоначальный цвет индикатора (рисунок 6.44).

Рисунок 6.44 - Цветная реакция: 1 – исходный цвет питательной среды; 2 – изменение цвета среды в результате метаболизма клеток; 3 – сохранение исходного цвета среды в результате гибели клеток под действием вирусов.

Питательные среды для культур клеток подразделяются на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды применяются для выращивания клеточных культур. Они обогащены сыворотками крови человека или животных. Количество сыворотки составляет 2-30%. Поддерживающие среды применяются для сохранения монослоя клеток после заражения их вирусами. Оптимальное значение рН (7,2-7,6) при культивировании вирусов поддерживают с помощью бикарбонатного буфера. В качестве индикатора используют феноловый красный, который становится оранжево-желтым при закислении и малиновым при защелачивании среды.

6.10.Вопросы для контроля усвоения материала

1.Какую форму имеют вирионы?

2.Какими методами изучают размеры и форму вирионов?

3.Каковы особенности строения вирусов бактерий?

4.На какие типы подразделяются вирионы по своей структуре?

5.Охарактеризуйте строение просто устроенных вирусов.

6.Каково строение сложно устроенных вирусов?

7.Назовите типы симметрии вирусов.

8.Каковы функции нуклеиновых кислот вирусов?

9.В чем отличие позитивных и негативных вирусных РНК?

10.Назовите виды вирусных белков.

11.Каковы функции вирусных белков?

12.Какие вирусные ферменты Вы знаете?

13.Дайте характеристику липидов, входящих в состав вирионов.

14.Охарактеризуйте углеводы, входящие в состав вирионов.

15.Что такое жизненный цикл вирусов?

16.Назовите этапы жизненного цикла вирусов.

17.Расскажите о репродукции ДНК-содержащих вирусов.

18.Расскажите о репродукции плюс-РНК-содержащих вирусов.

215

19.Расскажите о репродукции минус-РНК-содержащих вирусов.

20.Какими способами дочерние вирионы выходят из клетки?

21.Назовите методы культивирования вирусов.

22.Какие эффекты наблюдаются при репродукции вирусов в организме лабораторных животных?

23.Как проявляется репродукция вирусов в РКЭ?

24.Какие эффекты наблюдаются при репродукции вирусов в культуре клеток?

6.11.Тренировочные тесты

1.Приоритет открытия вирусов принадлежит (один правильный ответ):

1.1.А. Левенгуку

1.2.Р. Коху

1.3.И.И. Мечникову

1.4.Д.И. Ивановскому

1.5.Л. Пастеру

2.Уникальными свойствами вирусов являются (несколько правильных ответов):

2.1.облигатный внутриклеточный паразитизм

2.2.наличие двух типов нуклеиновых кислот (ДНК и РНК)

2.3.наличие только одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК)

2.4.дизъюнктивный способ репродукции

2.5.рост на сложных питательных средах

3.Химический состав сложных вирусов представлен (несколько правильных ответов):

3.1.пептидогликаном

3.2.белками

3.3.нуклеиновыми кислотами

3.4.углеводами

3.5.липидами

4.Структурными компонентами сложных вирусов являются (несколько правильных ответов):

4.1.ядро

4.2.капсид

4.3.клеточная стенка

4.4.геном

4.5.суперкапсид

5.Морфологическими субъединицами капсида вирусов являются (один правильный ответ):

5.1.нуклеиновые кислоты

5.2.капсомеры

5.3.тейхоевые кислоты

216

5.4.пили

5.5.полисахариды

6. Типы симметрии вирусов (несколько правильных ответов):

6.1.круговой

6.2.спиральный

6.3.сегментированный

6.4.кубический

6.5.комбинированный

7.Молекулярную массу вирусов определяют с помощью (один правильный ответ):

7.1.аналитических весов

7.2.фильтрации через бактериальные фильтры

7.3.электронной микроскопии

7.4.ультрацентрифугирования

7.5.световой микроскопии

8.Оболочечные вирусы чувствительны к (несколько правильных ответов):

8.1.антибиотикам

8.2.эфиру

8.3.хлороформу

8.4.сульфаниламидам

8.5.желчным кислотам

9.В основу современной классификации вирусов заложены следующие критерии (несколько правильных ответов):

9.1.тип нуклеиновой кислоты

9.2.тип симметрии

9.3.наличие или отсутствие суперкапсида

9.4.облигатный внутриклеточный паразитизм

9.5.круг восприимчивых хозяев

10.Размеры вирусов выражаются в (один правильный ответ):

10.1.метрах

10.2.сантиметрах

10.3.микрометрах

10.4.нанометрах

10.5.миллиметрах

11. По форме вирусы подразделяются на (несколько правильных ответов):

11.1.кубические

11.2.сферические

11.3.пулевидные

11.4.палочковидные

11.5.цилиндрические

217

12.Вирусы размножаются (один правильный ответ):

12.1.спорами

12.2.митозом

12.3.бинарным делением

12.4.дизъюнктивной репродукцией

12.5.почкованием

13.Процесс репродукции вирусов начинается со стадии (один правильный ответ):

13.1.проникновения вируса в клетку

13.2.адсорбции на клетке

13.3.синтеза нуклеиновой кислоты

13.4.синтеза белка

13.5.депротеинизации

14.В состав сложных вирусов входит (несколько правильных ответов):

14.1.геном (ДНК или РНК)

14.2.аппарат Гольджи

14.3.рибосомы

14.4.капсид

14.5.суперкапсид

15.Вирусный геном, выполняющий в процессе репродукции функцию иРНК, называется (один правильный ответ):

15.1.репродуктивным

15.2.вирулентным

15.3.плюс-нитевой РНК

15.4.рекомбинантным

15.5.минус-нитевой РНК

16.Характерными свойствами вирусов являются (несколько правильных ответов):

16.1.наличие одного типа нуклеиновой кислоты

16.2.способность синтезировать токсины

16.3.отсутствие белоксинтезирующего аппарата

16.4.дизъюнктивный тип репродукции

16.5.способность к росту на сложных питательных средах

17.В состав простых вирусов входят (несколько правильных ответов):

17.1.нуклеиновая кислота

17.2.капсид

17.3.суперкапсид

17.4.матриксный белок

17.5.аппарат Гольджи

18. В состав сложных вирусов входят (несколько правильных ответов):

18.1.геном

18.2.мезосомы

218

18.3.суперкапсид

18.4.матриксный белок

18.5.лизосомы

19.Выход дочерней вирусной популяции из инфицированной клетки происходит путем (несколько правильных ответов):

19.1.эндоцитоза

19.2.почкования

19.3.лизиса клетки

19.4.деления клетки

19.5.образования цист

20.Сборка дочерних вирионов протекает (один правильный ответ):

20.1.во внеклеточном пространстве

20.2.в мезосомах

20.3.в рибосомах

20.4.в цитоплазме клеток

20.5.в митохондриях

21.Культивирование вирусов осуществляют (несколько правильных ответов):

21.1.в жидкой питательной среде

21.2.на плотной питательной среде

21.3.в РКЭ

21.4.в организме лабораторных животных

21.5.в культуре клеток

22.Вирусы – это (один правильный ответ):

22.1.грамположительные микроорганизмы

22.2.грамотрицательные микроорганизмы

22.3.неклеточные формы жизни

22.4.продуценты интерферона

22.5.продуценты антител

23.Репродукция вирусов может происходить (несколько правильных ответов):

23.1.в клеточных культурах

23.2.в мясо-пептонном бульоне

23.3.на кровяном агаре

23.4.в среде 199

23.5.в организме лабораторных животных

24.Сущность научного открытия Ивановского Д.И. (один правильный ответ):

24.1.создание первого микроскопа

24.2.открытие вирусов

24.3.открытие явления фагоцитоза

24.4.получение антирабической вакцины

24.5.открытие явления трансформации

220

16.1, 16.3, 16.4, 17.1, 17.2, 18.1, 18.3, 18.4, 19.2, 19.3, 20.4, 21.3, 21.4, 21.5, 22.3, 23.1, 23.5, 24.2, 25.2, 26.2, 27.1, 27.3, 28.1, 28.5, 29.3, 29.4, 30.1, 30.2, 30.5.