Иллюстрационное пособие по общей микробиологии

291

ответ):

10.1.этиловый спирт

10.2.масляная и уксусная кислоты

10.3.молочная кислота

10.4.молочная кислота и этиловый спирт

10.5.метиловый спирт

11. Основными продуктами спиртового брожения являются (один правильный ответ):

11.1.этиловый спирт и углекислый газ

11.2.масляная и уксусная кислоты

11.3.молочная кислота

11.4.молочная кислота и этиловый спирт

11.5.метиловый спирт

12. Основными продуктами молочнокислого брожения являются (один правильный ответ):

12.1.пропиловый спирт

12.2.масляная и уксусная кислоты

12.3.муравьиная кислота

12.4.молочная кислота, уксусная кислота и этиловый спирт

12.5.метиловый спирт

13. У бактерий выделяют следующие типы переноса веществ внутрь клетки (несколько правильных ответов):

13.1.активный транспорт

13.2.фагоцитоз

13.3.транслокация радикалов

13.4.простая диффузия

13.5.облегченная диффузия

14. Пермеазы – это (один правильный ответ):

14.1.адгезины

14.2.ферменты агрессии

14.3.транспортные белки

14.4.группа антибиотиков

14.5экзоферменты

15. Перенос веществ внутрь клетки без затраты энергии происходит при (несколько правильных ответов):

15.1.активном транспорте

15.2.транслокации радикалов

15.3.облегченной диффузии

15.4.пассивной диффузии

15.5.экзоцитозе

292

16. Перенос веществ внутрь клетки с затратой энергии происходит при (несколько правильных ответов):

16.1.активном транспорте

16.2.пассивной диффузии

16.3.облегченной диффузии

16.4.транслокации групп

16.5.экзоцитозе

17.В факторах роста нуждаются (один правильный ответ):

17.1.аутотрофы

17.2.гетеротрофы

17.3.ауксотрофы

17.4.прототрофы

17.5.фототрофы

18.К факторам роста относятся (несколько правильных ответов):

18.1.витамины

18.2.пурины

18.3.пиримидины

18.4.аминокислоты

18.5.антибиотики

19.В какой фазе отсутствует прирост микробной популяции (несколько правильных ответов):

19.1.лаг-фаза

19.2.фаза экспоненциального роста

19.3.стационарная фаза

19.4.фаза ускоренного отмирания

19.5.лог-фаза

20.В какой фазе наблюдается максимальный прирост микробной популяции (несколько правильных ответов):

20.1.лаг-фаза

20.2.фаза экспоненциального роста

20.3.стационарная фаза

20.4.фаза ускоренного отмирания

20.5.лог-фаза

21.Не растут в присутствии кислорода (один правильный ответ):

21.1.облигатные аэробы

21.2.факультативные анаэробы

21.3.облигатные анаэробы

21.4.микроаэрофилы

21.5.аэротолерантные бактерии

22. Растут в присутствии кислорода (несколько правильных ответов):

293

22.1.облигатные аэробы

22.2.факультативные анаэробы

22.3.облигатные анаэробы

22.4.микроаэрофилы

22.5.капнофилы

23.Сахаролитические свойства бактерий оценивают (один правильный ответ):

23.1.на мясо-пептонном агаре

23.2.в мясо-пептонном бульоне

23.3.в столбике желатина

23.4.на средах Гисса

23.5.в среде 199

24.О сахаролитической активности бактерий судят по образованию в среде (несколько правильных ответов):

24.1.кислоты

24.2.воды

24.3.кислоты и газа

24.4.сероводорода

24.5.индола

25.“Пестрый ряд” используют для определения (один правильный ответ):

25.1.морфологических свойств

25.2.тинкториальных свойств

25.3.сахаролитических свойств

25.4.протеолитических свойств

25.5.липолитических свойств

Правильные ответы: 1.3, 2.2, 3.3, 4.2, 4.5, 5.1, 5.3, 5.5, 6.1, 7.2, 8.5, 9.3, 10.2, 11.1, 12.4, 13.1, 13.3, 13.4, 13.5, 14.3, 15.3, 15.4, 16.1, 16.4, 17.3, 18.1, 18.2, 18.3, 18.4, 19.3, 19.4, 20.2, 20.5, 21.3, 22.1, 22.2, 22.4, 22.5, 23.4, 24.1, 24.3, 25.3.

294

9. Культуральное исследование

Целью культурального исследования является выделение чистой культуры возбудителя и его идентификация путем изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств. При необходимости проводят фаготипирование и серотипирование возбудителя, определение чувствительности микроба к антибактериальным препаратам и вирулентности.

Культуральное исследование включает 4 этапа:

I этап - посев исследуемого материала на питательные среды для получения изолированных колоний;

II этап – пересев микробных клеток из отдельных колоний на скошенный агар в пробирках для накопления чистой культуры возбудителя;

III этап – проверка чистоты выделенной культуры и изучение биохимических свойств (в первую очередь - сахаролитической и протеолитической активности) для идентификации возбудителя (определения вида бактерий);

IV этап - учет результатов и выдача заключения.

9.1. Отбор, хранение и транспортировка материала

Взятие материала для проведения культурального исследования, его хранение и транспортировку осуществляют с соблюдением определенных правил.

Материал для культурального исследования отбирается из мест локализации патологического процесса. Исследуемым материалом может служить кровь, моча, гной, мокрота, фекалии, желчь, отделяемое раны, рвотные массы, смывы с кожи и слизистых оболочек и др. Материал для исследования отбирается с соблюдением правил асептики. Для взятия крови используют вакуумные пробирки (вакуумные системы), для мочи и кала – специальные стерильные контейнеры (рисунок 9.1).

а б в Рисунок 9.1 – Вакуумные системы для забора крови (а), контейнеры для мочи и кала

(б), система для сбора и транспортировки образцов мочи на бакпосев с тампономгубкой (в). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для отбора биологического материала часто используют тампоны (свабы). Для этих целей выпускаются тампоны в комплекте с транспортной средой – так называемые транспортные системы (рисунок 9.2).

295

Рисунок 9.2 – Стерильные транспортные системы. Заимствовано из Интернетресурсов.

При исследовании крови на наличие бактерий (получение гемокультуры) материал отбирают непосредственно во флаконы, содержащие одновременно плотную и жидкую питательные среды, так называемые двухфазные системы (рисунок 9.3).

Рисунок 9.3 – Флакон с двухфазной системой. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Биологический материал для культурального исследования отбирается до начала антибиотикотерапии или через определенный промежуток времени, достаточный для выведения антибиотика из организма.

При отборе материала исключают попадание в него антибиотиков, антисептиков, дезинфектантов.

Транспортировку биологического материала в лабораторию проводят в максимально короткие сроки при соблюдении температурного режима. При невозможности быстрой доставки пробы в лабораторию материал погружают в транспортные среды и хранят в холодильнике при температуре плюс 4ОС. Транспортировку биологического материала в лабораторию осуществляют в специальных пеналах или термоконтейнерах (рисунок 9.4).

296

Рисунок 9.4 – Медицинский термоконтейнер. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Материал, содержащий анаэробные бактерии, транспортируют в условиях, исключающих воздействие кислорода. Для взятия такого материала используют специальные флаконы, заполненные бескислородной газовой смесью и специальной транспортной средой (рисунок 9.5).

Рисунок 9.5 – Флаконы для культивирования анаэробов. Заимствовано из Интернетресурсов.

Материал для культурального исследования направляют в лабораторию с сопроводительным документом, в котором указывают фамилию, имя, отчество больного, возраст, вид материала, дату взятия, предполагаемый клинический диагноз и другие сведения.

В микробиологической лаборатории поступивший на исследование материал регистрируют в журнале, сохраняют до конца исследования, а по завершению исследования остатки материала уничтожают путем автоклавирования.

9.2. Посев материала на питательные среды и выделение чистой культуры аэробных бактерий

Поступивший в лабораторию материал подвергают исследованию в тот же

297

день. На первом этапе из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсией (определение присутствия возбудителя, его морфологических и тинкториальных свойств). Обязательным этапом культурального исследования является выделение чистой культуры микробов. С этой целью исследуемый материал высевают на плотную питательную среду и инкубируют в термостате в течение 18-24 часов при температуре 37ОС. Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную на питательной среде из изолированной микробной колонии. Микробная колония – это видимое невооруженным глазом скопление бактерий на поверхности или в толще плотной питательной среды. Колония представляет собой потомство, как правило, одной бактериальной клетки. Чистая культура используется для изучения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств, по совокупности которых проводится идентификация, то есть определяется видовая принадлежность исследуемых бактерий.

Для получения изолированных колоний предложены разные методы разобщения клеток:

-метод Пастера – последовательные разведения исследуемого материала в жидкой питательной среде (представляет исторический интерес);

-метод Коха – последовательные разведения исследуемого материала в расплавленном агаре с последующим переносом агара с разведенной культурой в чашку Петри – метод также представляет исторический интерес (рисунок 9.6);

Разведения

Исследуемый материал

Рисунок 9.6 – Получение изолированных колоний методом Коха.

- метод Дригальского – последовательный перенос исследуемого материала с помощью шпателя из одной чашки в последующие 2-3 чашки с агаром (рисунок

9.7);

298

Рисунок 9.7 – Получение изолированных колоний по методу Дригальского.

- посев штрихами с помощью бактериологической петли или тампона (рисунок 9.8).

Рисунок 9.8 – Схема посева штрихами (а, цифрами указана последовательность нанесения штрихов) и результат посева (б).

При выделении чистых культур из смешанной популяции бактерий используются различные приемы, позволяющие “обогатить” исследуемый материал патогенными возбудителями. Например, при низкой концентрации патогенных бактерий в исследуемом материале, особенно загрязненном посторонней микрофлорой, применяют биологический метод – выделение культуры после заражения лабораторных животных.

Химический метод (обработка исследуемого материала химическими веществами) применяется для уничтожения сопутствующей микрофлоры (обработка материала кислотой при выделении кислотоустойчивых микобактерий туберкулеза).

Физический метод (прогревание исследуемого материала) используется при выделении спорообразующих бактерий.

Техника посева зависит от характера исследуемого материала и консистенции питательной среды. Жидкий материал для посева берут бактериологической петлей или стерильной пипеткой. Все манипуляции проводят вблизи пламени горелки с соблюдением правил асептики. Бактериологическую петлю перед взятием материала и по окончании посева прокаливают в пламени горелки. Пипетки после посева погружают в дезраствор.

Наибольшее распространение для выделения чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий получили метод посева штрихом и метод Дригальского. При посеве штрихом стерильной петлей берут каплю исследуемого материала и наносят его параллельными штрихами на поверхность агара в чашке Петри. В начале посева на петле имеется большое количество микробов, поэтому

299

рост будет сплошным. С каждым штрихом на петле остается все меньше микробов, поэтому отмечается рост изолированных колоний. Посев штрихом имеет множество вариантов (рисунок 9.9).

Рисунок 9.9 – Варианты посева штрихами. Цифрами обозначена последовательность нанесения штрихов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Шпателем по методу Дригальского исследуемый материал распределяется по поверхности среды в нескольких чашках Петри. При этом вначале материал распределяют по поверхности агара в первой чашке Петри, затем этим же шпателем материал переносят на последующие чашки. На первой чашке отмечается сплошной рост культуры, а на последующих пластинках агара выявляются изолированные колонии.

На втором этапе исследования изолированные колонии описывают по форме (правильная, неправильная, округлая, розеткообразная и т.д.), величине (крупные, средние, мелкие), прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная), цвету (бесцветные, пигментированные), характеру поверхности (гладкая, блестящая, влажная и др.), рельефу (выпуклые, погруженные, с валиком по краю и т.д.).

Из отдельных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсией. Для приготовления мазка используют часть колонии. При однородной микроскопической картине остаток колонии пересевают на скошенный агар в пробирку для накопления чистой культуры. Посевы инкубируют в термостате, как правило, при температуре 37ОС в течение суток.

На третьем этапе исследования отмечают характер роста культуры на скошенном агаре, готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют с иммерсией. По однородности роста культуры на агаре, микроскопической картине (однородность формы, размеров и окраски) судят о чистоте выделенной культуры. Затем проводят идентификацию чистой культуры путем изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств. При необходимости изучают дополнительные свойства, характеризующие видовую принадлежность выделенного микроба.

300

Морфологические (размер и форма микробных клеток) и тинкториальные (отношение к окраске по Граму) свойства изучают при микроскопии окрашенных по Граму мазков.

Культуральные свойства изучают по характеру роста культуры на плотной и в жидкой питательной среде. При этом описывают признаки колоний, образующихся на плотной питательной среде, и особенности роста культуры в жидкой питательной среде.

Для идентификации чистой культуры изучают различные биохимические свойства.

Ферментация углеводов (сахаролитические свойства) определяется на средах Гисса, содержащих один из моно-, дисахаров (глюкозу, лактозу, сахарозу и др.), полисахаридов (крахмал, гликоген и др.), высших спиртов (глицерин, манит и др.) и индикатор. В пробирку со средой помещают поплавок для улавливания газа. При ферментации углеводов образуется либо кислота, либо кислота и газ (углекислый газ, водород, метан). Образование кислоты выявляется изменением цвета среды, а образование газа – появлением пузырька в поплавке.

Ферментацию белков определяют путем посева культуры в столбик питательного желатина, на свернутую сыворотку крови, на молочный агар. При посеве в столбик желатина при положительной реакции отмечается его разжижение. На свернутой сыворотке вокруг колоний в положительном случае образуется углубление, а на молочном агаре вокруг колоний формируется зона просветления.

Расщепление белков в некоторых случаях сопровождается образованием индола (продукт расщепления триптофана), аммиака (продукт расщепления фенилаланина) или сероводорода (продукт расщепления цистина, цистеина или метионина). Для выявления этих газообразных веществ используют индикаторные бумажки или специальные реактивы.

Более подробно изучение ферментативной активности бактерий представлено в разделе 8.

Для определения пути расщепления глюкозы (окислительный или бродильный) используют ОФ-тест (тест окисления – ферментации, окислительнобродильная проба). Для этого исследуемую культуру высевают уколом в две пробирки, содержащие полужидкую питательную среду, глюкозу и индикатор бромтимоловый синий. В одну из пробирок вносят слой вазелинового масла для создания анаэробных условий. Разложение глюкозы сопровождается образованием кислоты и изменением цвета среды на желтый. Образование кислоты в обеих пробирках свидетельствует о ферментативном пути расщепления глюкозы. Образование кислоты только в пробирке без вазелинового масла свидетельствует об окислительном пути расщепления глюкозы. Отсутствие кислотообразования в обеих пробирках свидетельствует об отсутствии утилизации глюкозы (рисунок 9.10).