Иллюстрационное пособие по общей микробиологии

311

базовый набор включает гены так называемого “домашнего хозяйства”. Гены “домашнего хозяйства” отвечают за репликацию, транскрипцию, трансляцию, метаболизм. Вспомогательные гены определяют морфофизиологические признаки, приспособленность к определенной экологической нише и другие признаки.

Гены объединены в опероны. Ген обозначают строчными буквами латинского алфавита с надстрочным знаком “+”. Это обозначение соответствует названию соединения, синтез которого данный ген детерминирует. Например, his+ обозначает ген, отвечающий за синтез гистидина (гистидиновый ген). Гены, контролирующие устойчивость (резистентность) к лекарственным или иным препаратам, выделяют надстрочным символом r, а чувствительность – надстрочным знаком s. Например, резистентность к стрептомицину обозначается как strr, а чувствительность к стрептомицину – strs.

В составе ДНК микроорганизмов выявляют следующие компоненты:

-простые повторяющиеся последовательности (SSR), состоящие из 2-6

нуклеотидов, которые могут повторяться несколько раз (например, ЦАТ ЦАТ ЦАТ);

-CpG – мотивы (островки) – неметилированные последовательности нуклеотидов, богатые гуанином и цитозином. Эти мотивы распознаются Tollподобными рецепторами клеток защитной системы организма.

Описание функциональных и структурных характеристик генома называется аннотированием генома. Этот процесс включает в себя маркировку генов, местонахождение генов и механизмов их регуляции, содержание Г+Ц-пар, положение CpG-островков, повторяющихся последовательностей, транспозонов, геномных повторов, IS-элементов и др.

Геном микроорганизмов графически отражают в виде концентрических колец. Схема, отражающая расположение генов на хромосоме, называется

генетической картой хромосомы (рисунок 10.7).

Рисунок 10.7 – Генетическая карта хромосомы кишечной палочки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Совокупность генов называется генотипом. Генотип проявляется внешними признаками. Совокупность внешних признаков организма называется фенотипом. Понятия генотип и фенотип сформулировал в начале ХХ века датский генетик В.

312

Иогансен (рисунок 10.8).

Рисунок 10.8 – Вильгельм Людвиг Иогансен (Wilhelm Ludvig Johannsen, 1857 – 1927

гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Фенотип бактерий обозначается теми же знаками, что и генотип, но заглавными буквами. Например, символы Strr или Strs обозначают наличие устойчивости или чувствительности к стрептомицину. Фенотип зависит не только от наличия соответствующего гена, но и от условий, способствующих его проявлению.

Сохранение информации при росте и размножении клеток происходит следующим образом. Перед делением клетки на каждой цепи ДНК происходит синтез новой цепи, комплементарной родительской. При этом каждая из двух вновь образуемых спиралей содержит родительскую цепь и вновь синтезированную цепь. Одновременно с синтезом новой молекулы ДНК синтезируется и матричная (информационная) РНК (мРНК или иРНК). Она состоит из одной цепи и напоминает цепь ДНК, только вместо тимина содержит урацил. Матричная РНК копирует нуклеотидную последовательность ДНК. Этот процесс называется транскрипцией (переписыванием информации). Порядок триплетов мРНК определяет аминокислотную последовательность белков, синтезируемых в клетке. После транскрипции у микроорганизмов сразу же происходит трансляция – синтез белковой молекулы на рибосомах. У микроорганизмов трансляция совмещена с транскрипцией.

У бактерий выделяют следующие основные признаки:

-морфологические (размер и форма клеток, наличие жгутиков, спор и

капсул);

-тинкториальные (способность воспринимать различные красители);

-культуральные (характер роста бактерий в жидких и на плотных питательных средах);

-биохимические (способность расщеплять углеводы, белки, липиды и другие сложные соединения);

-антигенные (наличие антигенов, способных индуцировать синтез антител);

-биологические (патогенность, тропность);

-резистентность к лекарственным препаратам, факторам внешней среды, бактериофагам.

Все признаки бактерий проявляются в результате биохимических реакций, которые осуществляются при участии ферментов. В нормальных условиях у

313

бактерий все присущие им ферменты работают, что проявляется характерными для этих бактерий свойствами. Совокупность этих признаков позволяет отличать одни виды бактерий от других. В некоторых случаях ферменты перестают работать. Например, фермент перестает работать при отсутствии условий для его нормальной работы или в случае поломки гена, кодирующего синтез данного фермента. В результате нарушения работы ферментов возникают изменения признаков, характерных для данного вида бактерий, что затрудняет идентификацию микроорганизмов.

Наследственная информация у бактерий закодирована в геноме, который представлен нуклеоидом (бактериальной хромосомой), а у некоторых бактерий дополнительно плазмидами. В состав нуклеоида и плазмид могут входить мобильные элементы генома (подвижные генетические элементы), к которым относятся IS-последовательности и транспозоны. Хромосомные и плазмидные гены, а также мобильные генетические элементы являются функциональными единицами генома. Кроме того, каждая генетическая структура (нуклеоид, плазмида), способная к самостоятельной репликации, составляет единицу репликации или репликон.

Нуклеоид большинства бактерий представлен одной замкнутой кольцевой молекулой ДНК. Нуклеоид и плазмиды фиксированы в определенных точках на цитоплазматической мембране клетки. Структура генома (наследственного аппарата) бактерий представлена на рисунке 10.9.

Рисунок 10.9 – Геном бактериальной клетки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Нуклеоид бактерий представляет собой двухцепочечную кольцевую суперспирализованную молекулу ДНК. Длина этой молекулы достигает 1 мм (превышает длину бактериальной клетки в 1000 раз). Диаметр молекулы ДНК составляет около 2 нм. Нуклеоид большинства бактерий имеет молекулярную массу в пределах (1-3)·109 Д. Молекулярная масса нуклеоида микоплазм составляет (0,4- 0,8)·109 Д, а нитчатых цианобактерий - 8,5·109 Д. Нуклеоид бактерий содержит до 3- 5 млн. нуклеотидных пар (н.п.), которые формируют до 4 тысяч генов. Гены бактериальной хромосомы кодируют (определяют) жизненно важные для бактерии функции питания, дыхания, роста и размножения.

Нуклеоид бактерий, несмотря на отсутствие ядерной мембраны, четко отграничен от цитоплазмы и занимает в ней центральную область. Для выявления

314

нуклеоида в фиксированных мазках предложена реакция Фёльгена-Россенбёка. При электронной микроскопии нуклеоид выглядит в виде менее плотных участков в центральной части клетки (рисунок 10.10).

Рисунок 10.10 – Расположение нуклеоида бактериальной клетки при электронной микроскопии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

На рисунке 10.11 представлена фотография молекулы хромосомной ДНК кишечной палочки, полученная с помощью электронной микроскопии.

Рисунок 10.11 – ДНК кишечной палочки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

У большинстваХромосомыбактерий нуклеоидхолерногопредставибрионален одн й молекулой ДНК. У некоторых бактерий, например, у холерного вибриона нуклеоид образуют две молекулы ДНК, которые называют хромосомами (рисунок 10.11).

Рисунок 10.11 – Хромосомы холерного вибриона. Заимствовано из Интернетресурсов.

Кроме нуклеоида у некоторых бактерий в клетке могут присутствовать плазмиды - небольшие автономные (внехромосомные) двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды расположены в цитоплазме клетки и способны к

315

самостоятельной репликации (вне зависимости от репликации хромосомы). По размерам плазмиды составляют 0,1-5% нуклеоида. Плазмиды имеют молекулярную массу порядка 106-108 Д и содержат 103-106 н.п., формирующих 40-50 генов (рисунок 10.12).

Рисунок 10.12 – Электронная микрофотография молекулы плазмидной ДНК. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Особенности геномов некоторых бактерий представлены в таблице 10.1.

Таблица 10.1 – Состав и размеры геномов некоторых бактерий

Клетка, содержащая плазмиды, обладает дополнительными (селективными) преимуществами по сравнению с бесплазмидными бактериями. При утрате плазмид основные свойства клетки не изменяются.

Для выявления плазмид применяют следующие способы:

-биофизические способы основаны на выявлении в клетках плазмидной ДНК с помощью градиентного ультрацентрифугирования или электрофореза;

-биологические способы основаны на обнаружении у бактерий дополнительных признаков, не характерных для данного вида микробов.

Количество молекул плазмидной ДНК в клетке характеризуется термином “копийность плазмид”. По количеству молекул одного вида плазмид, присутствующих в одной клетке, плазмиды подразделяются на однокопийные и многокопийные. Мелкие плазмиды присутствуют чаще всего в клетке в большом количестве (10-30 копий на клетку), а крупные плазмиды – в количестве 1-2 копий на клетку. По способности присутствовать в одной клетке одновременно плазмид нескольких видов они подразделяются на совместимые и несовместимые. Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерии) и интегрированные (встроенные в хромосому клетки) плазмиды. Плазмиды также подразделяют на

317

Рисунок 10.14 – Перенос генов посредством Hfr-плазмиды. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

R-плазмиды (от resistance - устойчивость) представляет собой молекулу ДНК, содержащую гены, детерминирующие устойчивость к антибиотикам. R- плазмиды могут передаваться от одних бактерий другим при трансформации, трансдукции и конъюгации. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим способствует возникновению антибиотикоустойчивых штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий, что затрудняет химиотерапию вызываемых ими заболеваний. Схематическое изображение одной из R-плазмид представлено на рисунке 10.15.

Рисунок 10.15 – Схематическое изображение плазмиды pBR322, детерминирующей устойчивость к ампициллину (Ap) и тетрациклину (Tc). PstI, EcoRI и BamHI – сайты рестрикции соответствующими ферментами. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Тох-плазмиды (плазмиды токсигеноости) контролируют свойства патогенности бактерий. Нередко плазмидные tox+-гены кодируют синтез интактных протоксинов (например, дифтерийного или ботулинического токсинов), активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом. К плазмидам патогенности относятся также такие

318

плазмиды как Ent-плазмиды, кодирующие синтез энтеротоксинов, Hly-плазмиды, детерминирующие синтез гемолизинов.

Col-плазмиды (англ. colicinogeny - колициногенность) детерминируют синтез колицинов (бактериоцинов), которые подавляют рост и размножение чувствительных к ним родственных бактерий. Этот феномен впервые обнаружил в 1925 г. А. Gratia у кишечной палочки и назвал его колициногенией (рисунок 10.16).

Рисунок 10.16 – Проявление феномена колициногении. Заимствовано из Интернетресурсов.

Вдальнейшем аналогичные белковоподобные вещества были обнаружены у многих видов бактерий, поэтому их стали называть бактериоцинами, а феномен - бактериоциногенией. Бактериоцины обнаружены у кишечной палочки (колицины), возбудителя чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины) и других бактерий. Col-факторы Е. coli детерминируют синтез различных типов колицинов (более 25). Col-плазмиды имеют молекулярную массу 25-150·106 Д. Способность продуцировать различные типы колицинов используется для типирования бактерий с целью эпидемиологического анализа вызываемых ими заболеваний. Такое типирование осуществляется путем определения типа Со1плазмиды (колициногенотипирование) или типа колицина, образуемого патогенными бактериями (колицинотипирование), выделенными от больных, контактирующих с ними лиц, а также из окружающей среды.

D-плазмиды (плазмиды биодеградации) кодируют синтез ферментов деградации различных соединений (мочевины, толуола, камфоры), необходимых бактериям в качестве источников углерода или энергии. Например, кишечные палочки, выявляемые при инфекциях мочеполового тракта, содержат плазмиду биодеградации мочевины.

Скрытые (криптические) плазмиды не содержат генов, которые можно было бы обнаружить по их фенотипическому проявлению. Такие плазмиды выявляются с помощью биофизических методов.

Всостав генома некоторых бактерий (как в состав нуклеоида, так и плазмид) входят подвижные (мигрирующие) генетические элементы (мобильные элементы генома – МЭГ) – отдельные участки ДНК, способные осуществлять собственный перенос (транспозицию) внутри генома. Транспозиция связана с тем, что подвижные элементы содержат гены, определяющие синтез специфического фермента - транспозазы. К мобильным элементам генома относятся вставочные или

319

инсерционные последовательности (IS-элементы), транспозоны (Tn-элементы), интегроны и островки патогенности.

Вставочные или инсерционные последовательности (IS-элементы, англ. insertion - вставка, sequence - последовательность) представляют собой короткие фрагменты ДНК, способные целиком перемещаться как из одного участка репликона в другой участок того же репликона, так и между репликонами (например, между нуклеоидом и плазмидами). Их величина в среднем составляет 800-1400 н.п. IS-элементы не способны реплицироваться самостоятельно. Они не кодируют фенотипических признаков, так как не несут структурных генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность ISпоследовательностей перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки), то есть ген транспозазы и ген репрессора (рисунок 10.17).

Рисунок 10.17 - Схема строения IS-элемента. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

IS-элементы одинаковы у разных бактерий и выполняют следующие функции:

-обеспечение рекомбинации транспозонов, плазмид и умеренных фагов с нуклеоидом бактериальной клетки и между собой;

-инактивация генов, расположенных в области интеграции IS-элемента;

-индукция мутаций при встраивании в бактериальную хромосому. Транспозоны (Тn-элементы) - это сегменты ДНК, способные как и IS-

элементы к перемещению внутри репликона и между репликонами. Однако в отличие от IS-элементов транспозоны имеют более крупные размеры, так как содержат структурные гены, определяющие фенотипически проявляющиеся признаки (токсигенность, биохимические свойства, устойчивость к антибиотикам). В связи с этим транспозоны легко выявляются. Они состоят из 2000-25000 пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два концевых длинных инвертированных повтора, которые могут состоять из ISэлементов (рисунок 10.18).

Рисунок 10.18 - Схема строения транспозона. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

320

Транспозоны легко перемещаются по хромосоме. При включении в бактериальную хромосому и исключении из нее транспозоны могут вызывать различные виды мутаций (делеции, дупликации, инверсии). Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и проявляют свои свойства только в составе другого репликона (бактериальной хромосомы или плазмиды). Транспозоны легко перемещаются с одного репликона на другой (например, с бактериальной хромосомы на плазмиду или ДНК фага). Это способствует широкому распространению транспозонов в бактериальной популяции.

Интегрон представляет собой систему захвата малых элементов ДНК (генных кассет) посредством сайт-специфической рекомбинации. В состав

Рисунок 10.19 – Схема строения интегрона. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Генные кассеты содержат в основном ген антибиотикоустойчивости и сайт рекомбинации. Интеграза включает гены кассеты в интегрон таким образом, чтобы гены антибиотикоустойчивости могли экспрессироваться с промотора Р интегрона. Генные кассеты способны перемещаться с одного интегрона на другой.

Еще одним важным структурным элементом генома патогенных бактерий являются острова (островки) патогенности. Острова патогенности – это участки ДНК протяженностью не менее 10000 пар нуклеотидов, которые имеют состав Г-Ц- пар, отличающийся от других участков генома бактериальной клетки. Эти участки

детерминируют синтез факторов патогенности, которые обеспечивают развитие патологического Островокпроцесса ма роорганизмепатогенности. Схема роения островков

патогенности представлена на рисунке 10.20.

Рисунок 10.20 – Схема строения островка патогенности. Заимствовано из Интернет-

• Располагается вблизиресурсовгенов. тРНК. По обоим

его концам находятся прямые повторы (DR), в начале - ген, кодирующий интегразу, далее следуют один или несколько генов