Иллюстрационное пособие по общей микробиологии

321

Острова патогенности располагаются вблизи генов тРНК, обычно по флангам, они имеют прямые повторы (DR) последовательностей ДНК или ISэлементы, в самом начале находится ген, кодирующий интегразу, далее – один или несколько генов вирулентности (V1 – V4) и IS-элементы. Большинство островов патогенности локализовано на хромосоме бактерий (Salmonella), но также они могут находиться в составе плазмид (Shigella) и фаговых ДНК (V. cholerae O1, O139).

Наука о строении и функционировании генома называется геномикой. Геномика изучает следующие вопросы:

-хранение генетической информации (геном и отдельные гены на молекулярном, индивидуальном и популяционном уровнях);

-передачу генетической информации (механизмы экспрессии и регуляции генов, возможности переноса генов в другие системы);

-реализацию генетической информации в конкретные свойства и признаки организма;

-причины и механизмы изменения генетической информации на разных этапах развития организма, взаимосвязи между генами и их эволюцию;

-клонирование организмов и использование знаний в генно-инженерных

целях;

-создание естественной классификации микроорганизмов (генеалогического древа) на основе генетических признаков;

-разработку высокоточных методов диагностики и идентификации микроорганизмов - определение плазмидного профиля, рестрикционный анализ, молекулярная гибридизация, ПЦР, секвенирование.

В настоящее время выделяют следующие направления геномики:

1.Структурная геномика изучает первичную структуру генома (секвенирование генома), границы генов и их организацию, структуру белков и других биомолекул клетки, организацию генома. Использует методы картирования, секвенирования, рентгенструктурного анализа, биоинформатики.

2.Функциональная геномика изучает функции генов и механизмы регуляции их активности, экспрессию генов при физиологических и патологических процессах. Использует методы биоинформатики, клонирования, направленного мутагенеза, ядерно-магнитного резонанса. Биоинформатика – это направление биологии, основанное на компьютерном анализе первичной, вторичной, третичной структуры молекул ДНК, молекул РНК и белков. Для этого используются специальные компьютерные программы и информационные базы данных.

3.Эволюционная геномика проводит сравнительный анализ от признака к гену, использует эти знания в таксономических целях, выявляет родственные связи между организмами.

Разделы геномики:

Транскриптомика изучает транскриптомы (совокупность мРНК клетки) и изменения в них в зависимости от среды и стадии развития.

Протеомика изучает закономерности функционирования белков клетки в конкретный период ее развития, характер и последствия их биологических взаимодействий, роль в регуляторных и эффекторных процессах.

Метаболомика изучает метаболиты и изменения в их составе в разные фазы жизненного цикла.

323

Культуральная изменчивость проявляется в образовании колоний разной величины и формы (рисунок 10.22).

Рисунок 10.22 – Изменение формы колоний при длительном выращивании бактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Одной из форм культуральной изменчивости бактерий считают диссоциацию колоний. При посеве на мясо-пептонный агар в чашки Петри микроорганизмы образуют колонии двух основных типов: S-форма - гладкие колонии (от англ. smooth - гладкий); R-форма - шероховатые колонии (от англ. rough - шероховатый). Феномен образования бактериями разных форм колоний впервые описали в 1917 г. австрийский микробиолог Эдмунд Вейль (1880-1922 гг.) и чехословацкий бактериолог Артур Феликс (1887-1956 гг.). Диссоциация сопровождается изменением биохимических, морфологических, антигенных и патогенных свойств возбудителей.

Свойства клеток из колоний R-формы:

Колонии шероховатые, морщинистые, края колоний изрезанные. Жгутики отсутствуют.

Капсула (слизистый слой) отсутствует. Биохимическая активность снижена.

Вирулентность для лабораторных животных снижена. Антигенная структура неполноценная. Чувствительность к фагу снижена.

Клетки полиморфные.

Свойства клеток из колоний S-формы:

Колонии прозрачные, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, с ровными краями, выпуклые.

У подвижных видов имеются жгутики.

Хорошо выражена капсула или слизистый слой. Выраженная биохимическая активность. Высокая вирулентность.

Антигенная полноценность. Чувствительность к фагу выражена. Клетки типичной формы и размеров.

Большинство патогенных микробов образует колонии S-формы. Некоторые

324

патогенные бактерии (например, В. anthracis) на обычных питательных средах (МПА) образуют колонии R-формы, сохраняя при этом вирулентные свойства, а на специальных питательных средах (сывороточная среда, атмосфера углекислого газа)

– колонии S-формы.

Изменчивость ферментативных (биохимических) свойств обусловлена способностью бактерий синтезировать адаптивные ферменты. Эти ферменты вырабатываются на определенных питательных субстратах и предопределены генотипом. Например, кишечная палочка, растущая на среде без лактозы, не синтезирует разлагающий лактозу фермент, но если пересеять культуру на среду с лактозой, то она начнет вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты позволяют микробам приспосабливаться к определенным условиям существования.

Генотипическая (наследственная) изменчивость - это изменение свойств бактерий в результате “поломок” генетического материала под влиянием различных факторов. Генотипическая изменчивость сопровождается передачей приобретенных признаков по наследству. Ей присущи низкая частота возникновения и редкая реверсия в исходную форму.

Генотипическая изменчивость развивается в результате следующих событий:

-мутации - изменение последовательности азотистых оснований в ДНК;

-рекомбинации - перенос участков ДНК от бактерии-донора в бактериюреципиент.

Мутации (mutatio - изменение) – это скачкообразные изменения свойств бактерий. Термин “мутация” предложил голландский ботаник Хуго де Фриз как “скачкообразное изменение наследственного признака” у растений. Позднее голландский микробиолог Мартин Бейеринк распространил это понятие на бактерии (рисунок 10.23).

А Б

Рисунок 10.23 – А - Хуго де Фриз (Hugo de Vries, 1848 – 1935 гг.), Б - Мартин Бейеринк (Martinus Willem Beijerinck, 1851 – 1931 гг.). Заимствовано из Интернетресурсов.

Отечественные микробиологи Г.А. Надсон и Г.С. Филиппов установили, что после воздействия ионизирующим излучением на дрожжевые клетки возникали разнообразные расы, свойства которых воспроизводились в потомстве.

Мутация – это качественное или количественное изменение первичной

325

структуры ДНК, в результате которого утрачивается или изменяется какой-либо признак или группа признаков. Эти изменения могут возникать под влиянием эндогенных или экзогенных факторов. Бактерии с измененными признаками называются мутантами.

Классификация мутаций:

1. По происхождению:

-спонтанные (внутренние) мутации;

-индуцированные (внешние) мутации. 2. По протяженности:

-точечные мутации;

-генные мутации;

-хромосомные мутации.

3.По направленности: - прямые мутации; - обратные мутации.

4.По локализации:

-хромосомные мутации;

-плазмидные мутации. 5. По функции:

-летальные мутации;

-сублетальные мутации;

-нейтральные мутации. 6. По фенотипу:

-морфологические мутации;

-функциональные мутации (резистентность, ауксотрофность).

Причинами мутаций могут быть внутренние и внешние факторы. Соответственно этому выделяют спонтанные и индуцированные мутации.

Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают под влиянием внутренних (эндогенных) факторов в результате ошибок ДНК-полимеразы во время репликации ДНК или в результате недостаточности механизмов репарации (механизмов исправления ошибок). Частота спонтанных мутаций достигает 1·10-5 - l·10-10. Наиболее распространенным типом спонтанных мутаций у бактерий является ауксотрофность, то есть утрата способности к синтезу какого-либо соединения. Такой мутант называют ауксотрофным по данному соединению. В норме почти все ошибки ДНК-полимеразы исправляются с помощью ферментов репараз. Однако некоторые спонтанные мутации могут закрепиться в потомстве. Например, Л. Пастер в 1881 г. получил вакцину против сибирской язвы, выращивая возбудитель в течение длительного времени при повышенной температуре (42,5ОС). В настоящее время известно, что ослабление вирулентности сибиреязвенного микроба (аттенуация) возникло в результате утраты одной из плазмид. А. Кальмет и Ш. Герен в 1919 г. путем длительных пассажей на питательной среде получили вакцинный штамм микобактерий туберкулеза (вакцину БЦЖ).

Индуцированные (направленные) мутации возникают под действием внешних химических, физических или биологических факторов. Частота возникновения индуцированных мутаций достигает 10-4-10-7, то есть во много раз выше частоты спонтанных мутаций. Физические факторы, вызывающие мутации,

326

называются мутагенными факторами. К ним относятся УФ-излучение, γ- излучение, температура. Химические вещества, вызывающие мутации, называются мутагенами. К мутагенам относятся, в частности, соли азотистой кислоты, акридиновые красители, оксилители, производные нитрофурановогоряда, аналоги азотистых оснований. Бактерии с измененными признаками называются

мутантами.

Мутации, приводящие к потере функции, называются прямыми. Восстановление исходных свойств называется реверсией. При реверсии исходный генотип может восстанавливаться (обратная мутация) или восстановления исходного генотипа не происходит (супрессорная мутация).

По протяженности (количеству мутировавших генов) выделяют точечные, генные и хромосомные мутации. Точечные мутации затрагивают чаще всего одно основание, генные мутации – один ген, а хромосомная мутация – несколько генов. При некоторых мутациях образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из аминокислот. Такие мутации называют бессмысленными или нонсенс-

мутациями.

Нейтральные мутации фенотипически не проявляются какими-либо изменениями признаков. Условно-летальные (сублетальные) мутации приводят к изменению функциональной активности синтезируемого фермента, но не к утрате синтетической способности. Летальные мутации характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важные для бактериальной клетки ферменты.

Выделяют следующие типы мутаций.

Делеция - это выпадение одного или нескольких пуриновых или пиримидиновых оснований (рисунок 10.24).

Рисунок 10.24 – Схема формирования делеций.

Инсерция – это вставка одного или нескольких пуриновых или пиримидиновых оснований (рисунок 10.25).

Рисунок 10.25 – Схема формирования инсерций.

Транзиция - это замена пурина на пурин или пиримидина на пиримидин (рисунок 10.26).

327

Рисунок 10.26 – Схема формирования транзиций.

Трансверсия - это замена пурина на пиримидин или пиримидина на пурин (рисунок 10.27).

Рисунок 10.27 - Схема формирования трансверсий.

Дупликация – это удвоение количества пуриновых или пиримидиновых оснований (рисунок 10.28).

А-Т-Г-Ц-Т-А-А-Ц-Г-Г

А-Т-Г-Ц-Т-А-А-Ц-Ц-Г-Г Рисунок 10.28 – Схема формирования дупликаций.

Дислокация (транслокация) – это перемещение пуриновых или пиримидиновых оснований (рисунок 10.29).

Рисунок 10.29 – Схема возникновения дислокаций.

Инверсия – это переворот пуриновых или пиримидиновых оснований относительно друг друга (рисунок 10.30).

328

Рисунок 10.30 – Схема формирования инверсий.

Некоторые химические вещества значительно повышают частоту мутаций. В частности, аналоги азотистых оснований включаются в молекулу ДНК и вызывают вставку некорректного основания при репликации. Бромурацил, включаясь в ДНК, узнаётся полимеразой как цитозин, в результате чего вместо аденина включается гуанин. Азотистая кислота дезаминирует азотистые основания. Интеркалирующие агенты (акридиновые красители) внедряются между основаниями ДНК и вызывают увеличение расстояния между ними, что приводит к утрате нуклеотидов или включению дополнительной пары нуклеотидов.

В мутантных клетках существуют механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру ДНК. Способность исправлять повреждения в молекуле ДНК называется репарацией. Репарация осуществляется специальными ферментными системами клетки. Клеточные ферменты репарации выполняют строго определенные функции:

-ферменты, узнающие измененные участки ДНК и осуществляющие разрыв цепи рядом с поврежденным участком;

-ферменты, удаляющие поврежденные участки ДНК;

-ферменты, синтезирующие участок ДНК взамен удаленного;

-ферменты, восстанавливающие непрерывность цепи ДНК.

У бактерий выделяют 3 основных механизма репарации:

-прямая репарация (исходная структура нуклеотидов восстанавливается в одну стадию);

-эксцизионная репарация (удаление поврежденных оснований с последующим восстановлением исходной структуры ДНК);

-пострепликативная репарация (после репликации образуется ДНК, имеющая одноцепочечные бреши, которые заполняются в процессе рекомбинации).

К прямой репарации относится световая репарация или фотореактивация

(исправление повреждения ДНК под действием УФ-лучей). Световая репарация осуществляется с помощью таких ферментов как фотолиаза, метилтрансфераза, инсертаза, гликозилаза. Под действием конкретного фермента безошибочно восстанавливается исходная структура ДНК.

При эксцизионной репарации место повреждения распознается эндонуклеазой, которая расщепляет ДНК вблизи дефекта. Затем поврежденный фрагмент удаляется, а в образовавшуюся брешь при помощи ДНК-полимеразы встраиваются отсутствующие нуклеотиды (ресинтез нуклеотидной цепи на основе неповрежденной матрицы). Схема репарации ДНК представлена на рисунке 10.31.

329

Сшивка разрыва ДНК-лигазой

Удаление поврежденного участка

Повреждение

Восполнение дефекта ДНК-полимеразой

Рисунок 10.31 – Схема репарации ДНК. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Рекомбинация - это форма изменчивости, обусловленная переносом участка ДНК от бактерии-донора в бактерию-реципиент. При этом происходит взаимодействие между двумя молекулами ДНК с образованием рекомбинантной ДНК, сочетающей гены обоих родителей.

Различают следующие виды рекомбинаций:

1. Гомологичная рекомбинация. Она происходит под контролем генов REC-системы (гены recA, B, C, D). При гомологичной рекомбинации взаимодействуют ДНК с высокой степенью гомологии (рисунок 10.32).

Рисунок 10.32 – Схема гомологичной рекомбинации. Заимствовано из Интернетресурсов.

2. Сайт-специфическая рекомбинация не зависит от REC-системы и гомологии ДНК. Она наблюдается при встраивании плазмид и умеренных фагов в определенные участки бактериальной хромосомы за счет IS-элементов (рисунок

10.33).

330

Рисунок 10.33 – Схема сайт-специфической рекомбинации. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

У бактерий выделяют следующие механизмы переноса ДНК:

-трансформация;

-конъюгация;

-трансдукция.

Трансформация (преобразование, перестройка) - это изменение свойств бактерий в результате поступления (поглощения, искусственного введения) в клетку-реципиент из окружающей среды свободного фрагмента ДНК, изолированного из клетки-донора. Трансформация возможна как in vivo, так и in vitro. Явление трансформации открыл в опытах на пневмококках в 1928 г. английский генетик Ф. Гриффит (рисунок 10.34).

Рисунок 10.34 – Фредерик Гриффит (Frederick Griffith, 1879 - 1941 гг.).

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Эксперимент Ф. Гриффита заключался в следующем. Пневмококки на питательном агаре могут образовывать колонии S- и R-формы. Пневмококки, синтезирующие капсулу, формируют на плотной питательной среде гладкие колонии S-формы. При введении мышам капсульных пневмококков отмечается гибель животных (рисунок 10.35).