53. История и проблемы развития культивирования животных клеток. Основные культивируемые элементы.

Первые опыты по культуре животных тканей были проведены немецким биологом В. Ру, которому удалось в 1885 г. в течение нескольких дней поддерживать развитие нервной пластинки куриного эмбриона в теплом солевом растворе. Однако лишь предложенная американским биологом Р. Гаррисоном в 1907 г. воспроизводимая техника послужила основой для дальнейшего развития метода культивирования животных клеток вне организма.

Культивируя в сгустках лимфы небольшие кусочки нервной трубки эмбриона лягушки, Гаррисон через несколько недель наблюдал образование нервных волокон. Французский хирург и патофизиолог А. Каррель, сумевший в течение 34 лет сохранять у штамма клеток сердца куриного эмбриона способность к активным делениям, доказал таким образом, что животные клетки могут неограниченно долго расти в культуре in vitrо.

Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований − от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Культуру животных тканей применяют для изучения механизмов роста и дифференцировки клеток, гистогенеза, межтканевых и межклеточных взаимодействий, обмена веществ и т. п. Культуры животных клеток являются важными продуцентами многих биологически важных веществ. На них выращивают вирусы для их идентификации и получения вакцин. Клеточные культуры часто применяют при тестировании и изучении механизма действия лекарственных и косметических средств, пестицидов, консервантов и т. п. Методы культуры клеток нашли широкое применение для реконструкции различных тканей и органов.

Так, культура клеток кожи используется для заместительной терапии при ожогах, культура клеток эндотелия − для реконструкции стенок сосудов. Способность клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияния клеток, что, в свою очередь, вызвало становление новой области науки − генетики соматических клеток. Органные культуры используют при изучении закономерностей развития органов, для изучения способов сохранения жизнеспособности изолированных органов, предназначенных для трансплантации. В настоящее время практически любые клетки человека и животных могут быть введены в культуру и тем самым служить средством и объектом во многих медико-биологических исследованиях. Наиболее часто культивируются следующие элементы:

• соединительной ткани – фибробласты; • скелетной – кость и хрящи; • мышечной – скелетные, сердечные и гладкие мышцы;

• эпителиальной – печень, легкие, кожа, мочевой пузырь, почки, молочная железа;

• нервной – глиальные клетки и нейроны (хотя они лишены способности к пролиферации);

• эндокринной системы – гипофиз, надпочечники, клетки островков Лангерганса;

• различные типы опухолевых клеток.

54. Возможности и способы получения и особенности существования первичных культур.

Свежевыделенные культуры носят название первичных культур до начала пассирования или субкультивирования. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки. После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Свойством "бессмертности" обладают в основном клетки, полученные из опухолей. Нормальные клетки могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом злокачественными.

Первичные культуры клеток получают путем стерильного удаления фрагмента ткани и его механической или ферментативной (0,01−0,05– 0,25 % трипсин, 200−2000 ед./мл коллагеназа) дезагрегации(разрушение структуры). В случае механической дезагрегации фрагмент ткани измельчают до кусочков размером около 1 мм, которые прикрепляются к субстрату благодаря собственной адгезивности, поверхности субстрата или сгустку плазмы. Ферментативная дезагрегация дает более высокий выход клеток, хотя метод является селективным, поскольку не все клетки переживают диссоциацию.

На практике наиболее успешное получение первичных клеток из многих тканей связано с использованием коллагеназы, приводящим к снижению размера экспланта до небольшого кластера клеток, который прикрепляется к субстрату и распластывается. Культуры первичных клеток легко получить из многих тканей. Какое-то время эти клетки экспоненциально размножаются, но затем примерно через 6 месяцев скорость роста культуры снижается, а через 10 месяцев клетки деградируют и погибают. Это наблюдается примерно после 20−50 генераций (в зависимости от возраста тканей-источников первичных клеток: из эмбриональной – 50, из взрослой – 20). На ранних стадиях клетки обладают правильным диплоидным набором хромосом.

При успешном установлении культуры первичные клетки начинают размножаться и их необходимо периодически пересевать (субкультивировать). Субкультивирование обеспечивает возможность продления существования культуры (получение линии клеток), клонирования, исследования и сохранения клеток, а также получения более однородных популяций. Главным преимуществом получения клеточных линий из первичных культур является наработка большого количества стабильного материала, пригодного для продолжительного использования.