33. Потребность в кислороде и аэрация. Культивирование анаэробных микроорганизмов.

Для роста и развития аэробных микроорганизмов необходим кислород. Он окисляет органические субстраты и обеспечивает клетки энергией. В отличие от других питательных веществ кислород очень плохо растворяется в воде и в растворах солей. Растворимость кислорода в ферментационных жидкостях обычно составляет не более 4—7 мг/л. Такое количество кислорода обеспечивает потребность культуры в течение нескольких минут, поэтому при культивировании аэробных микроорганизмов обязательным условием является аэрация культуральной жидкости. При аэрации происходит непрерывный транспорт кислорода из газовой фазы в жидкую к клеткам микроорганизмов, а также отвод от них образующегося диоксида углерода. Потребность культуры микроорганизмов в кислороде зависит от ряда факторов, в частности от концентрации микроорганизмов в культуральной жидкости, вида используемого углеродсодержащего субстрата, вида и штамма применяемых микроорганизмов.

Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве.

К физическим методам создания анаэробных условий относится культивирование в микроанаэростате – вакуумном аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СО₂ и 10 % Н₂.

К химическим методам относится:

1) Использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы.

2) Использование восстанавливающих агентов, которые добавляют в большинство сред для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, аскорбиновая кислота.

Как пример биологического способа создания анаэробных условий - выращивание совместно с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. Например, питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой – анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется только после полного использования кислорода аэробом.

Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре: выращивание в высоком слое среды; выращивание в толще плотной среды; заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.

34. Динамика роста культуры микроорганизмов и характерные особенности каждой фазы.

При внесении микроорганизмов в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание питательных веществ не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Процесс роста и размножения микроорганизмов в такой системе описывается кривой роста , которая имеет S-образную форму.

1 – лаг фаза (фаза адаптации). Внесенные в питательную среду клетки микроорганизмов приспосабливаются к условиям и составу среды, размножения практически не происходит. Продолжительность этой фазы (может длиться от нескольких часов до нескольких суток) зависит от состава питательной среды, рН, температуры, возраста и количества внесенных клеток

П – логарифмическая или экспоненциальная фаза роста. Это стадия интенсивного размножения. Скорость размножения максимальна. В этой фазе большинство клеток является биологически активными и молодыми. Если культуру в данной фазе развития перенести в другую емкость с аналогичным субстратом, то скорость роста микроорганизмов не изменится. В этом случае лаг-фаза отсутствует. Если же пересев происходит во время другой стадии, то фаза адаптации обязательно будет присутствовать. Клетки по размеру мелкие, так как почкование опережает рост, но большая поверхность таких клеток обеспечивает высокую скорость биохимических процессов. На этой стадии культура более чувствительна к действию неблагоприятных факторов.

Ш фаза - замедленного роста. Скорость размножения замедляется, так как постепенно изменяется состав среды: снижается концентрация питательных веществ, увеличивается плотность культуры в единице объема, накапливаются продукты обмена веществ клеток, которые в определенной концентрации могут угнетать нормальную жизнедеятельность культуры микроорганизмов.

IV фаза – стационарная. Наступает, когда концентрация клеток перестает увеличиваться и число их в единице объема становится максимальным. Скорость размножения равна скорости отмирания. В этот период в результате жизнедеятельности клеток в культуральной среде накапливаются продукты обмена веществ, которые имеют важное практическое значение (ферменты, антибиотики и др.).

V фаза - отмирания. Это период, когда в результате истощения питательной среды и максимального накопления продуктов обмена скорость отмирания клеток намного превышает скорость их размножения. Происходит автолиз — распад белков мертвых клеток под действием собственных ферментов. Фаза отмирания является противоположностью логарифмической фазы роста.