46. Получение культуры каллусных клеток.

Каллусная культура – это неорганизованная профилирующая(делящаяся) ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные, т.е. становятся таким образом дифференцированными. Каллус может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in vitro, так и на растении при поражении.

Этапы получения каллуса:

1. Выбор экспланта

Эксплант - фрагмент ткани или органа, используемый для получения первичного каллуса. Лучшими эксплантами для получения каллуса являются: - молодая ткань; -ткань ответственная за пролиферацию (меристема).

Нежелательно использовать: - одревесневшие ткани; - старые ткани с низким уровнем метаболизма; - плохо пролиферирующие ткани (напр., мякоть плодов); -ткани, покрытые восками, суберином.

2. Стерилизация растительного материала.

На поверхности органов растений всегда находится эпифитная микрофлора. Эксплант должен быть освобожден от всех видов микроорганизмов (бактерий, грибов, микоплазм и т.д.). Поверхностная стерилизация освобождает эксплант от наружной инфекции.

ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА:

1) Предварительная стерилизация (проводят очистку поверхности путем ее промывания проточной водой; обработки этанолом (70%-ный раствор в течение 1 мин), растворами CuSO4 либо KMnO4)

2) Стерилизация (в условиях ламинар-бокса предварительно простерилизованные ткани помещают в стерилизующий раствор)

3) Постстерилизация (растительный материал отмывают от стерилизующего агента 3-4 порциями стерильной дистиллированной воды)

4) Перенос стерильных эксплантов на питательную среду

5) Получение первичного каллуса – При оптимально подобранной среде первичные каллусы в количестве достаточном для пересадки образуются в течение 3-8 недель в зависимости от вида растения.

6) Субкультивирование (пассирование) – Первичный каллус разделяют на части, которые в дальнейшем культивируются отдельно. Следует обратить внимание на размеры трансплантов, переносимых на свежую питательную среду: если они слишком малы, то дальнейший рост каллуса может быть угнетен.

Основным условием превращения растений клетки в каллусную является присутствие в питательной среде фитогормонов.

Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, приготавливающие её к делению, а цитокинины – пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток.

Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без верхушки) или любой другой эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деление клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется.

Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению. Каждая клетка имеет три фазы роста: 1) деление; 2) растяжение; 3) дифференцировку. Характерной чертой заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того, чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т.е. клетки как в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной ткани в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки.