Пищевая Биохимия / Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Биохимия сельскохозяйственной продукции

8.6. Использование ферментов

исследованиях. Основными источниками ферментов служат микроорганизмы, а также растительные и животные ткани. Всего исследовано более 3000 ферментов, которые могут быть выделены и использованы в чистом виде. В настоящее время наиболее крупные производства ферментов созданы в США, Японии, Франции и Германии.

Ферментными методами можно определять сами ферменты, а также их субстраты, активаторы и ингибиторы.

Вмедицине для борьбы с многочисленными устойчивыми к антибиотикам патогенными микроорганизмами используется лизоамидаза, эффективно убивающая клинические штаммы, на которые не действуют антибиотики. Кроме того, лизоамидаза применяется в гнойной хирургии, стоматологии, гинекологии при лечении трудно заживающих трофических язв. Ферментативный препарат с лизоамидазой обладает не только литическим действием на патогенные бактерии, но также способен очищать раны от некротических тканей, стимулирует заживление ран, обладает мощным иммуностимулирующим действием.

Вмедицинской практике используется препарат стрептокиназы, который обладает тромболитическим действием и поэтому используется для лечения тромбозов. Пенициллинацилаза из различных источников используется в фармацевтической промышленности для производства 6-аминопеницилловой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот, которые являются ключевыми соединениями синтеза новых пенициллинов и цефалоспоринов.

Впищевой промышленности, в частности в хлебопечении, используются амилазы, которые ускоряют процесс созревания теста и улучшают его качество. Эти ферменты применяют для получения растворимого крахмала, патоки, декстрина. Грибные амилазы могут заменять солод, тогда как лактаза может быть использована для удаления лактозы из молока. В кондитерской промышленности инвертазы сахаров применяются

сцелью предупреждения кристаллизации сахарозы. Цитазы используют для более полной экстракции соков из плодов и овощей, а также получения эфирных масел.

Каталаза и пероксидаза позволяют понижать концентрацию перекиси водорода в различных средах. Иммобилизованные формы целлюлаз применяют для расщепления крахмала из картофеля и зерна, а также увеличения выхода агар-агара из водорослей. Препараты целлюлазого комплекса гидролизуют полисахариды сырья, содержащего целлюлозу (клетчатку)

сцелью получения глюкозы. Протеолитические ферменты находят применение в сыроделии совместно с химозином. Липазы используют в производстве сухого молока и для ускорения созревания сыров.

Пектолитические ферменты применяются для обработки льносоломы и получения из нее волокна. В кожевенной промышленности применяют

133

Глава 8. Ферменты

протеазы для обезволашивания шкур и мягчения голья. Сложные ферментативные препараты, в составе которых пектиназы и гемицеллюлозы, используются для ускорения процессов силосования трудно- и несилосирующихся кормов. Для определения фунгицидов и пестицидов в плодах, ягодах, листьях применяют папаин и ацетилхолинэстеразу. Препарат алкогольдегидрогеназы используется для определения микроколичеств этилового спирта в выдыхаемом воздухе и в жидкостях. Этот препарат может выявлять содержание этанола в пределах 10–6…10–5 М.

Биолюминесцентная АТФ-метрия все больше находит свое применение в биохимии, медицине, биотехнологии и при мониторинге окружающей среды, поэтому препараты люциферазы светляков и бактерий находят применение в аналитических исследованиях определения АТФ в различных биологических жидкостях, При этом используются АТФ-ре- агенты, представляющие собой лиофилизированные многокомпонентные смеси, содержащие растворимую или иммобилизованную люциферазу, люциферин, компоненты буферного раствора и стабилизирующие добавки. В основе метода хемилюминесцентная реакция, катализируемая люциферазой. С помощью этого фермента можно определять в биологических жидкостях микроколичества различных метаболитов клеток (АТФ, ФМН, НАД+, НАДФ+ и др.), а также активность многих ферментов, катализирующих реакции с участием этих метаболитов. Люцифераза катализирует реакцию окисления люциферина в присутствии АТФ и Mg2+. Реакция абсолютно специфична по отношению к люциферину и АТФ

исопровождается излучением квантов света. Причем квантовый выход биолюминесценции близок к единице. Для измерения интенсивности биолюминесценции используют люминометр. АТФ в реакционную смесь впрыскивают с помощью разбавителя. Используя люциферазу, можно определить содержание АТФ в концентрациях от 50 нМ до 1 мМ или от 0,1 нмоль до 2 мкмоль в образце.

Спомощью уреазы в лабораторно-клинических исследованиях определяют содержание мочевины в исследуемых биологических жидкостях, а глюкозу определяют с помощью глюкозооксидазы и пероксидазы. Пероксидаза хрена и специфические антитела против нее широко используются в иммуноферментном анализе и иммуноцитохимии. Способов использования пероксидазных реакций в аналитических целях в настоящее время накопилось очень много. Однако особый интерес вызывают способы анализа веществ, используемых в реакциях совместного окисления. Так, например, амидопирин относится к классу пиразолонов, которые широко применяются в медицине в качестве жаропонижающих средств

ианальгетиков. Соединения этой группы используются и в диагностических целях, заменяя канцерогенные бензидин, о-толуидин, о-дианизи- дин. Поэтому совместное пероксидазное окисление 4-аминоантипирина

134

ГЛАВА 9

БИОГЕННЫЕ МОЛЕКУЛЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

В составе клеток растений и животных можно определить соединения органической природы, участвующие в энергетических процессах или обеспечивающие их протекание. Разнообразие молекул повышает информационный потенциал биогенной системы, увеличивает запас внутренней энергии, способствует проявлению многообразия межмолекулярных взаимодействий.

К энергетическим биогенным соединениям относятся в первую очередь высокоэнергетические фосфаты, в составе которых присутствует один или несколько остатков фосфорной кислоты РО(ОН)2. Связь, образованную между остатками органической молекулы и фосфорильной группой, принято называть макроэргической связью. В зависимости от природы соединения энергия связи определяется запасом стандартной свободной энергии, величина которой выражается в значениях – Go. Вычислить изменение стандартной свободной энергии можно, если известна величина константы равновесия Кр для химической реакции при заданной температуре.

При этом уравнение значения свободной энергии имеет следующее выражение:

Зная значение константы равновесия химической реакции при данной температуре можно всегда вычислить изменение стандартной свободной энергии. Таким образом, определенная величина стандартной свободной энергии для любого соединения есть количественный показатель свободной энергии связи, которая может высвободиться при ее разрушении. Знание этих величин позволяет определить изменения стандартной свободной энергии химической реакции, протекающей с участием соединений, всту-

136

Глава 9. Биогенные молекулы энергетических процессов

пающих в реакцию. Особое значение в живых организмах имеют биогенные соединения, в составе которых остаток фосфорной кислоты. Все они имеют разные значения Go. В табл. 9.1 приведены величины свободной энергии ( Go) гидролиза фосфорсодержащих биогенных соединений.

R P(OH)2=O + H2O → HO−P(OH)2=O + RH

При этом соединения с величинами больших отрицательных значений Go в условиях равновесия гидролизованы более полно, чем соединения,

расположенные ниже в столбцах табл. 9.1.

Та б л и ц а 9 . 1

Величины стандартной свободной энергии гидролиза фосфорсодержащих соединений при рН 7,0 (25 °С) и рК функциональных групп

Таким образом, соединения, расположенные в верхней части таблицы, легко отдают свои фосфорильные группы, тогда как соединения, расположенные ниже, стремятся их удержать. К группе высокоэнергетических

137

Глава 9. Биогенные молекулы энергетических процессов

доноров фосфата относятся 2-фосфоенолпируват и 1,3-дифосфоглицерат, а к низкоэнергетическим акцепторам фосфата — глюкозо-1-фосфат, фруктозо-6-фосфат, глюкозо-6-фосфат, глицерол-1-фосфат, фруктозо- 1-фосфат и др.

Как видно из табл. 9.1, промежуточное положение среди фосфорорганических биогенных соединений занимает АТФ (аденозин-5′-трифосфат), который выполняет роль посредника, участвуя в переносе фосфатных групп от высокоэнергетических соединений к акцепторным молекулам.

Высокоэнергетические соединения способны выполнять в клетке роль накопителей и переносчиков энергии в различные участки клетки и организма в целом. В растениях высокоэнергетические фосфаты способны проявлять регуляторное действие, участвуя в пусковых механизмах регуляторной системы (АТФ, ГТФ, цАМФ). Кроме того, они способны инициировать протекание и определять направленность некоторых метаболических процессов в клетке. Также они определяют протекание индивидуальных химических реакций, делая их практически необратимыми, вследствие высоких энергетических затрат, что характерно для реакций, катализируемых гексокиназой, фосфофруктокиназой, пируваткиназой и других, одним из субстратов которых служит АТФ. Реакции, протекающие в биогенных системах последовательно, называются сопряженными.

138

9.1. Нуклеозидфосфаты

E1 E2 E3 E4

A → B → C → D → E.

Здесь A, B, C, D — субстраты ферментов; E — продукт конечной ферментативной реакции; E1, E2, E3, E4 — ферменты.

При этом их суммарное изменение свободной энергии обеспечивает возможность образования конечного продукта. Направленность реакций определяется величиной свободной энергии. Так, если за реакцией, для которой величина Go положительна, следует реакция, для которой величина Go отрицательна, то вторая экзергоническая реакция может обеспечить протекание заданной последовательности реакций. Сопряженные реакции

реализуются в гликолизе, цикле трикарбоновых кислот и др. Высокоэнергетические соединения способны накапливать и перено-

сить энергию в форме макроэргических связей, обеспечивая энергетический потенциал двигательной активности живых организмов.

9.1. НУКЛЕОЗИДФОСФАТЫ

К высокоэнергетическим фосфатсодержащим соединениям относятся нуклеозидмоно-, нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфаты. В их состав входят азотистые основания (аденин, гуанин, цитозин и урацил), остаток рибозы и один, два или три остатка фосфорной кислоты (см. также гл. 4). Поэтому основными энергетическими соединениями считаются: АТФ (аденозин-5′-трифосфат), ГТФ (гуанозин-5′-трифосфат), УТФ (уридин- 5′-трифосфат), ЦТФ (цитидин-5′-трифосфат), АДФ (аденозин-5′-дифос- фат), ГДФ (гуанозин-5′-дифосфат), УДФ (уридин-5′-дифосфат) и др.

Нуклеозидтрифосфаты относятся к соединениям, способным запасать, переносить и отдавать энергию макроэргических связей, участвуя в различных химических реакциях. Причем основными переносчиками химической энергии в клетке служат АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ, которые присутствуют в каждой клетке живого организма в значительных количествах. При этом АТФ-зависимые реакции определяют направленность как процессов синтеза, так и распада в клетках живых организмов. Все нуклеозидтрифосфаты хорошо растворимы в полярных растворителях.

Аденозинтрифосфат (АТФ) — сложное соединение, образованное из азотистого основания аденина, рибозы и последовательно соединенных трех остатков фосфорной кислоты. Основным местом синтеза АТФ служат митохондрии, где в результате реакций окислительного фосфорилирования образуется высокоэнергетическая молекула. Для протекания этих реакций необходимы НАДН и ФАДН2. Кроме того, АТФ синтезируется в реакциях гликолиза.

139

Глава 9. Биогенные молекулы энергетических процессов

АТФ содержит макроэргические связи, гидролиз которых обеспечивает энергетические потребности, необходимые для протекания метаболических процессов в живых организмах. Продуктами расщепления АТФ в каталитических реакциях являются аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинмонофосфат (АМФ).

Полярность молекулы АТФ обеспечивается за счет четырех ОН-групп, способных к ионизации. Три из них имеют значение рК ≈ 2…3 и при физиологических рН 7,4 находятся полностью в диссоциированном состоянии.

Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ)

АДФ содержит три ОН-группы, способные к ионизации, две из которых полностью диссоциированы при рН 7,0. В клетках АТФ и АДФ присутствуют в виде комплексов с ионами Mg2+. (Кроме ионов магния с АТФ могут образовывать комплекс и ионы Mn2+.)

АТФ2– + Mg2+ → АТФ2–−Mg2+

Величины стандартной свободной энергии гидролиза двух высокоэнергетических связей АТФ равны –34,5 кДж · моль–1.

АТФ + Н2О → АДФ + Н3РО4

В ходе гидролиза АТФ фосфорилированная группа переносится на гид- роксид-ион. Гидролиз концевой фосфорильной группы АДФ практически имеет такую же величину, тогда как энергия фосфоэфирной связи у нуклеозидмонофосфата примерно в 4 раза меньше и поэтому она практически не используется в химических реакциях биогенных систем.

140

9.2. Циклические нуклеозидмонофосфаты

Другие нуклеозидтрифосфаты (УТФ, ГТФ и ЦТФ) выполняют в клетках узкоспециализированные функции, обеспечивая энергией только определенные химические реакции. Так, например, УТФ служит поставщиком энергии при синтезе крахмала, ЦТФ — при синтезе липидов, ГТФ ускоряет образование пептидной связи при биосинтезе белков.

В клетках живых организмов синтез АТФ может осуществляться в результате окисления органического субстрата метаболического процесса (гликолиз), в реакциях субстратного фосфорилирования. При этом происходит перенос остатка фосфорной кислоты с продукта окисления на АДФ. Такие реакции катализируют фосфоглицераткиназа (1) и пируваткиназа (2).

Кроме того, образование АТФ может протекать при участии ферментов, расположенных на внутренней мембране митохондрий, осуществляющих процесс окислительного фосфорилирования.

9.2. ЦИКЛИЧЕСКИЕ НУКЛЕОЗИДМОНОФОСФАТЫ

Важнейшими высокоэнергетическими соединениями клеток являются циклический 3′,5′-аденозинмонофосфат (цАМФ) и циклический 3′,5′-гуанозинмонофосфат (цГМФ). Оба соединения найдены в растениях. Синтезируются циклические монофосфаты из соответствующих нуклеозидтрифосфатов (АТФ и ГТФ). Реакции катализируют ферменты плазматических мембран — аденилатциклаза и гуанилатциклаза. Продуктом реакции является пирофосфат.

По-видимому, как и в организме животных, циклические нуклеотиды выполняют в растительном организме роль регулятора метаболических процессов.

141

Глава 9. Биогенные молекулы энергетических процессов

OO

+HOPO P OH

OH OH

Пирофосфат

9.3.БИОГЕННЫЕ МОЛЕКУЛЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД+) — сложное биологически активное соединение, функциональной активной частью которого является никотинамид — амидированное производное витамина РР. НАД+ выполняет роль акцептора протонов и электронов в реакциях, катализируемых окислительно-восстановительными ферментами, восстанавливаясь до НАДН. В митохондриях при окислении одной молекулы НАДН, синтезируются три молекулы АТФ.

Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ+) — фосфорилированная форма НАД+; участвует в катализируемых окислительно-восста- новительными ферментами реакциях в качестве кофермента. Восстановленная форма НАДФН генерируется преимущественно ферментами пентозофосфатного цикла и используется в процессе синтеза жирных кислот — липогенезе, а также синтезе холестерина.

Флавинадениндинуклеотид (ФАД) — сложное биологическое соединение, предшественником которого является витамин В2 (рибофлавин).

ФАД выполняет роль донора и акцептора электронов и протонов в окислительно-восстановительных реакциях, катализируемых специфичными дегидрогеназами. Восстановленной формой ФАД является ФАДН2, которая в основном генерируется в цикле трикарбоновых кислот (цикле Кребса) и в процессе липогенеза.

142