Пищевая Биохимия / Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Биохимия сельскохозяйственной продукции

Глава 7. Элементы

Аминокислотные остатки, содержащие серу, могут входить в состав активных центров ферментов, участвуя в каталитическом процессе. Сера

всоставе глутатиона обеспечивает участие трипептида в окислительновосстановительных реакциях. В составе кофермента А сера участвует

вреакциях трансаминирования, т. е. переносе ацильного радикала и его превращении в цикле трикарбоновых кислот, и в процессе синтеза жир-

ных кислот. Превращение ацетил- и сукценилрадикалов ферментами пируватдегидрогеназного и α-кетоглуторатдегидрогеназного комплексов осуществляется при участии липоевой кислоты.

Вмолодых листьях сера в основном находится в составе органических соединений. При старении растений сера накапливается в виде сульфата кальция. Недостаток серы сопровождается угнетением процесса биосинтеза белков, понижением фотосинтетической активности хлоропластов.

Цинк. Присутствует в растительных тканях в виде ионов Zn2+. Входит

всостав ключевых ферментов метаболических процессов карбоангидразы, фосфоглицеринальдегиддегидрогензы, лактатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, тимидинкиназы, РНК- и ДНКполимераз и др. Алкогольдегидрогеназа проявляет высокую активность

всеменах злаковых культур. Фермент катализирует окисление спиртов и восстановление альдегидов в присутствии коферментов НАД+ и НАДН. В составе холофермента две субъединицы (дрожжевая АДГ имеет четыре субъединицы), каждая из которых содержит по два атома цинка. Причем один атом цинка входит в состав каталитического центра фермента, располагаясь вблизи спиртовой оксигруппы. Этот ион цинка принимает участие в прямом гидридном переносе между субстратом и коферментом. В координировании атома цинка принимают участие два остатка цистеина и остаток гистидина. Четвертый координационный центр металла занят молекулой воды.

Из листьев шпината, петрушки и других растений выделен фермент карбоангидраза. Молекулярная масса фермента 140…170 кДа. Фермент содержит атом цинка, который участвует в каталитическом процессе гидратации СО2:

СО2 + Н2О ←→ Н2СО3 ←→ Н+ + НСО3–

Кроме того, ионы Zn2+ активируют ферменты, принимающие участие в синтезе индолил-3-уксусной кислоты из триптофана. Поэтому увеличение содержания цинка сопровождается ускорением роста и развития растений.

Молибден. Входит в состав ксантиноксидазы, ксантиндегидрогеназы, нитратредуктазы, нитрогеназы, сульфитоксидазы и альдегидоксидазы. Располагаясь в активном центре фермента, атом молибдена образует связь с серой, принадлежащей остатку цистеина. Кофактором молибденсодер-

113

Глава 7. Элементы

жащих ферментов служит флавиновая группа. Для растений молибден имеет наибольшую значимость в составе ферментов азотного обмена. Так, в нитрогеназе атом молибдена представлен в комплексе с железом. Нитрогеназа катализирует реакцию восстановления N2 до NH3.

Ферментативные реакции восстановления нитратов до нитритов и аммиака протекают при участии двух молибденсодержащих ферментов: НАДН-нитратредуктазы и ферредоксин-нитритредуктазы. Нитратредуктаза обладает также НАДФН-цитохром-с-редуктазной и ФАДН-нитратре- дуктазной активностью.

Ксантиноксидаза участвует в метаболизме пурина и его производных, тогда как альдегидоксидаза относится к флавогемопротеинам, катализирует реакции окисления альдегидов и производных хинолина и пиридина.

Железо. В растительном организме железо находится в виде восстановленной Fe2+- или окисленной Fe3+-формах. Входит в состав железосодержащих белков и ферментов (ферритин, пероксидаза, каталаза, ци- тохром-с-пероксидаза, цитохромоксидаза и др.), проявляет действие при наличии окисленной формы. Причем все гемсодержащие белки обладают пероксидазной активностью. Железо в составе протопорфирина IX принимает участие в окислительно-восстановительных реакциях фотосинтетического и окислительного фосфорилирования в составе цитохромов и ферридоксина.

Переносчиком железа в растительном организме служит ферритин. Этот белок способен связывать железо в нетоксичной и легко доступной форме. Железо, связанное с белком, образует комплексы гидратированного оксида железа с фосфат-ионом [(FeOOH)8(FeO:OPO3H2)]. Освобождение железа происходит после разрушения белка или путем восстановления до Fe2+ или образования хелатных соединений. Восстанавливающими Fe3+ → Fe2+ соединениями могут быть цистеин, аскорбиновая кислота

иглутатион. Ферритин больше всего накапливается в пластидах растительной клетки.

Хлор. Анионы Cl– совместно с ионами Na+ и K+ поддерживают осмотическое давление клеток. Ионы хлора обеспечивают формирование трансмембранного потенциала.

Медь. Содержится в растительных тканях в форме иона Cu2+. Особенно много ее накапливается в семенах и активно растущих частях растения. Входит в состав медьсодержащих белков и ферментов (аскорбатоксидаза, ортодифенолоксидаза, лакказа, галактозооксидаза, тиразиноксидаза, цитохромоксидаза, уратоксидаза, полифенолоксидаза, супероксиддисмутаза

идругие оксидоредуктазы), участвуя в их функционировании. Так, окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую протекает в две последовательные одноэлектронные стадии при участии аскорбатоксидазы. В ходе реакции происходит образование промежуточного свободного

114

Глава 7. Элементы

радикала, обнаруживаемого методом ЭПР. В процессе этой реакции медь, попеременно восстанавливаясь, окисляется. В реакции участвует кислород, который восстанавливается до перекиси водорода.

Медь также входит в состав ферментов, катализирующих окисление аминокислот. Так, тирозиназа при окислении катехинов катализирует реакцию восстановления кислорода до воды. Таким образом, медьсодержащие белки участвуют в процессах гидроксилирования, переноса кислорода и электронов. Недостаток меди в растительных тканях сопровождается замедлением роста и развития растения, потерей тургура и завяданием листьев.

Кобальт. Присутствует в живых организмах в виде Со2+ и Со3+. Кобальт входит в состав трансфераз, изомераз и дипептидазы. Ускоряет протекание ферментативной реакции с участием пируваткарбоксилазы, рибофлавинкиназы, щелочной фосфатазы, аргиназы, каталазы, альдолазы и др. В составе гемсодержащих белков (таких как каталаза, цитохромы и др.) участвует в синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, холина, метионина. Кроме того, входит в состав витамина В12, который синтезируется микроорганизмами.

Селен. В растительном организме селен действует как антиоксидант, т. е. подавляет образование свободных радикалов. Входит в состав глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы. Селен способен регулировать накопление гидроперокси- и гидроксипроизводных ненасыщенных жирных кислот (RH) и фосфолипидов, образование которых сопровождается следующей реакцией:

RH + O2 → ROOH

Восстановление гидропероксидов (ROOH) может протекать при участии глутатиона (Г-SH) в присутствии глутатионтрансферазы (1). Регенерация глутатиона осуществляется НАДФН и катализируется глутатионредуктазой (2).

1

ROOH + 2Г-SH → ROH + ГS-SГ + H2O

2

НАДФН + Н+ + ГS-SГ → НАДФ+ + 2Г-SH

Недостаток селена может сопровождаться проявлением апоптоза, т. е. угнетением роста и развития растений, преждевременным увяданием листьев.

Кремний. В природе кремний встречается в виде Si4+. В растительных и животных тканях Si4+ присутствует в водорастворимой форме в составе ортокремниевой кислоты и ортокремниевых эфиров. В составе органических соединений растительных тканей Si4+ образует ортокремниевые

115

ГЛАВА 8

ФЕРМЕНТЫ

Ферментами (энзимами) являются белки, имеющие функционально активную третичную или четвертичную структуру, обладающие каталитической активностью. В клетках живых организмов ферменты осуществляют контроль над протеканием химических реакций, определяют их направленность и скорость. С помощью ферментов проявляется специфичность и индивидуальность химических реакций в клетках растений и животных. Так как ферменты являются белками, то их синтез находится под контролем информативных молекул (ДНК и РНК) клеток, а информация об их первичной структуре записана в геноме растений и животных.

Химические реакции сопровождаются затратами энергии, запас которой обуславливает действие молекул, вступающих во взаимодействие. Суммарный запас энергии, необходимый для протекания химической реакции, называется энергией активации ( Е) и может быть выражен следующим образом:

Е = (Е1 + Е2) + (Е3 + Е4) или Е = Е1 + Е2

При этом затраты энергии необходимы для ориентации молекул в пространстве (Е1), сближения их относительно друг друга (Е2), а также энергетическими затратами используемых для разрыва старых связей (Е3) и образования новых связей (Е4). Запас энергии Е1 реализуется в движении молекул и определяется величиной энтропии, тогда как Е2 является энергией, запасаемой в связях, определяемой величиной энтальпии. При протекании ферментативной реакции Е1 служит энергией, обеспечивающей связывание субстрата в области активного центра фермента, тогда как Е2 — энергия, обуславливающая превращение субстрата в активном центре.

Величина энергетического барьера определяет возможность осуществления химической реакции. Чем выше это значение, тем медленнее протекает химический процесс.

117

Глава 8. Ферменты

8.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

От обычных функциональных белков ферменты отличаются тем, что на поверхности белковой глобулы у них располагается активный центр (рис. 8.1). Это участок, образованный из аминокислотных остатков, собранных из различных областей полипептидной цепи, где происходит связывание и превращение субстрата. При этом субстратом называется химическое соединение, претерпевающее изменение в ходе каталитического процесса. Кроме активного центра, у некоторых ферментов имеется еще и регуляторный участок (рис. 8.2). В этом участке связываются молекулы, оказывающие влияние на связывание и превращение субстрата в ферментативном процессе, хотя сами регуляторы не претерпевают изменений.

His;42

A

CD

Phe;142

B

Рис. 8.1. Пространственная структура (а) (Савицкий и др., 1998) и модель (б) (Veitch et al., 1992) активного центра пероксидазы

По размерам белковая глобула фермента превышает в несколько раз размеры субстрата. Это, возможно, обусловлено тем, что поверхностные аминокислотные остатки апобелка картируют поверхность клетки, определяя место связывания фермента на поверхности ее мембраны. При этом связывание поверхностных групп белка с функциональными группами мембранных структур определяет не только глубину его погружения в структуру мембраны, но и силу связывания белковой глобулы с поверхностными молекулами мембраны.

118

8.1. Физико-химические свойства ферментов

O

O

Рис. 8.2. Активный центр и регуляторный участок на поверхности белковой глобулы

В активном центре фермента могут располагаться аминокислотные остатки, содержащие различные функциональные группы, которые принимают участие в каталитическом процессе (табл. 8.1).

Условно активный центр фермента можно разделить на два участка: сорбционный, функциональные группы которого отвечают за связывание субстрата в активном центре фермента, и каталитический, в котором происходит превращение субстрата. Размер активного центра фермента определяется размером субстрата. Геометрия расположения функциональных групп активного центра соответствует природе субстрата, определяя эффективность его связывания и превращение в ходе химической реакции. Константа, характеризующая эффективность превращения субстрата в активном центре фермента, называется каталитической (kкат), а константа, определяющая сродство субстрата к ферменту, — константой связывания (Ks ≈ Km). Действие эффекторов (активаторов и ингибиторов) определяют с помощью констант активирования (Ка) и ингибирования (Ki), которые фактически являются равновесными константами.

Активность фермента зависит от проявления действия факторов среды и от свойств фермента. К факторам внешней среды можно отнести следующие:

•природа субстрата (субстратов) и концентрация;

•природа среды раствора;

119

Глава 8. Ферменты

•природа микросреды активного центра;

•температура, УФ облучение, давление;

•рН среды;

•присутствие активаторов и ингибиторов;

•ионная сила раствора.

Та б л и ц а 8 . 1

Функциональные группы ферментов и их рКа (Березин И. В. и др., 1976)

Действие факторов могут проявить наличие в среде активированных, ингибированных, денатурированных, модифицированных и рекомбинантных форм фермента.

К проявлению свойств фермента можно отнести следующее:

•природа и концентрация фермента;

•природа функциональных групп активного центра фермента, подвижность этих групп и их расположение;

•конформация белковой глобулы;

•межсубъединичные взаимодействия;

•наличие простетических групп и кофакторов;

•количество сульфгидрильных групп;

•количество изоферментов;

•наличие пассивной формы фермента (зимоген);

120

8.1.Физико-химические свойства ферментов

•рекомбинантные формы фермента;

•модифицированные формы фермента.

Влияние температуры. С повышением температуры активность ферментов возрастает, однако при температуре выше 40…60 °С наблюдается понижение активности фермента из-за разрушения нативной структуры белка. Возрастание температуры сопровождается увеличением подвижности функциональных групп в области активного центра и изменением конформации белковой глобулы, денатурацией фермента.

Влияние кислотности среды. Влияние рН на активность фермента проявляется через величины рК ионизирующих групп активного центра и функциональных групп субстрата. На активность фермента может также повлиять ионизация групп, входящих в состав белковой глобулы, преимущественно поверхностных аминокислотных остатков, приводящих к изменению конформации апобелка.

Изоферменты. Ферменты, имеющие одинаковый механизм действия, обладающие схожей субстратной специфичностью, но отличающиеся по физико-химическим свойствам, называются изоферментами. Различия между изоферментами проявляются в аминокислотном составе, сродстве к субстратам, температурном и рН оптимумах, действию ингибиторов и активаторов. Изоферменты можно разделить с помощью электрофореза, хроматографии, гель-фильтрации, ультрацентрифугирования. Синтез субъединиц изоферментов с четвертичной структурой находится под контролем различных генов, экспрессия которых зависит от их локализации

вразличных тканях растительного организма. Состав изоферментов может изменяться в зависимости от вида, сорта и возраста растения, фазы его развития, условий и места произрастания, функционального состояния, типа растительной ткани и органа. Так, в зерновках пшеницы методом электрофореза определяют от 7 до 10 изоформ малатдегидрогеназы, в корнях кукурузы — 4…5, в различных органах гороха — 9…12, в листьях хлопчатника — 7. Изоферментный состав пероксидазы из корней хрена представлен 10 изоформами, в листьях редьки их 18, в зародышах риса — 17,

влуковицах тюльпана — 12, в стеблях табака — 8.

Варьирование изоферментного состава сопровождается повышением адаптационных возможностей растительного организма, позволяя ему направленно изменять активность метаболических процессов, оказывая влияние на рост и деление клеток, развитие растительного организма, который способен за счет этого выработать механизмы, обусловливающие его приспособленность к окружающей среде,

Зимогены. Это неактивные формы ферментов (проферменты), относящиеся к группе протеиназ (сериновые, тиоловые, кислые); синтез зимогенов осуществляется на рибосомах эндоплазматического ретикулума особыми секреторными клетками в виде зимогенных гранул, которые после

121

Глава 8. Ферменты

завершения процесса мигрируют к поверхности клеток и затем секретируются в окружающую среду; достигнув места действия, они превращаются в активные формы ферментов. К ним относятся пепсиноген, активной формой которого является пепсин (основной протеолитический фермент желудочного сока), трипсиноген — трипсин, химотрипсиноген — химотрипсин, прокарбоксипептидазы — карбоксипептидазы (ферменты поджелудочной железы) и др. К зимогенам относятся и ферменты свертывания крови (факторы свертывания крови), компоненты и факторы системы комплемента.

8.2. ДЕНАТУРАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты в клетках живых организмов выполняют роль биологических катализаторов. В каталитическом действии фермента принимают участие аминокислотные остатки, содержащие –СООН, –NH2, –SH, –ОН и другие группы, входящие в состав активного центра, протонирование и депротонирование которых может влиять на его каталитические свойства. Поэтому активность ферментов зависит от рН среды, изменение которого может приводить к нарушению нативной структуры апобелка и конформации активного центра, что проявляется в утрате специфических каталитических свойств. Аналогично белкам, ферменты при повышении температуры изменяют свою конформацию, теряя способность катализировать превращения различных соединений. Так, например, пероксидаза катализирует реакцию окисления о-дианизидина перекисью водорода, однако длительное воздействие температурой выше 60 °С может приводить к денатурации фермента, уменьшению или к полной утрате его каталитической активности. Стабильность ферментов может возрастать в присутствии ионов Са2+, субстратов и белков, например альбумина.

8.3. КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

В настоящее время в соответствии с типом катализируемой реакции ферменты сгруппированы в 6 классов (рис. 8.3).

1 класс. Оксидоредуктазы — это ферменты, катализирующие реакции окисления и восстановления. Оксидоредуктазы подразделяются на 17 подклассов. Субстраты оксидоредуктаз являются донорами атомов водорода и электронов, и поэтому ферменты этого класса называются дегидрогеназами, или редуктазами (алкогольдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, глиоксилатредуктаза, гид-

122