Бабьева И. П., Чернов И. Ю. Биология дрожжей. М. Товарищество научных изданий КМК, 2004

ДРОЖЖЕВАЯ КЛЕТКА. ЦИТОЛОГИЯ

Дрожжевая клетка (рис. 2) имеет все основные структуры, которые присущи любой эукариотической клетке, но в то же время она обладает особенностями, свойственными грибам, а именно, сочетанием признаков как растительной, так и животной клеток: клеточная стенка у них ригидная, какурастений, новклеткеотсутствуютхлоропластыинакапливается гликоген, как у животных.

Такие структуры, как ядро с двойной мембраной, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и его производные, обнаруживаются в клетках всех дрожжей во все периоды клеточного цикла. Но в целом оченьсущественныеразличиянаблюдаютсявультраструктурнойорганизации и поведении отдельных органелл в зависимости от возраста клетки, внешних условий, стадии онтогенеза. Следует также отметить, что большинство сведений по цитологии дрожжей получено при изучении клеток Saccharomyces cerevisiae и некоторых других видов аско-

Рис. 2. Дрожжевая клетка под электронным микроскопом: цм – цитоплазматическая мембрана, кс – клеточная стенка, к – капсула, я – ядро, ям – ядерная мембрана, мх – митохондрии, л – включения липидов; снимки получены методом тонких срезов (слева) и замораживания-скола (справа).

11

мицетовых дрожжей. У других видов детали цитологического строения могут несколько отличаться.

Компоненты дрожжевой клетки Ядро. В дрожжевой клетке в фазе между делениями всегда имеется

только одно ядро. В световом микроскопе его можно увидеть после специальной окраски или с помощью фазово-контрастного устройства при высоких разрешениях. На электронно-микроскопических снимках ультратонких срезов дрожжевых клеток ядро выглядит как более или менееокруглаяорганелла, окруженнаядвойноймембранойнуклеолеммой. В ней есть поры в виде округлых сквозных отверстий, которые образуются в результате слияния двух ядерных мембран. Однако ядерные поры - не просто отверстия, они заполнены сложноорганизованными структурами, которые называют комплексом пор ядра. Считается, что основнаяфункцияядерныхпор - транспортготовыхрибосомныхсубъединиц в цитоплазму. Ядерная оболочка многофункциональна, но в основномиграет рольбарьера, отделяющего содержимое ядра ирегулирующего транспорт макромолекул между ядром и цитоплазмой.

Содержимое ядра, так называемый ядерный матрикс, имеет сложную, ноупорядоченнуюмногокомпонентнуюструктуру. Основныефункциональные единицы ядра - молекулы ДНК, несущие основную генетическую информацию о клетке. ДНК составляет основную часть хроматина - основногокомпонентаядра. Хроматинможетнаходитсявдиффузном состоянии при полной деконденсации хромосом в интерфазе, и в конденсированном, когда при делении ядра ДНК компактизируется и образует плотные хромосомы. Число хромосом в ядре разных видов дрожжей может быть различным, оно колеблется от 2 (Candida utilis) до 16 (Saccharomyces cerevisiae). На электронно-микроскопических снимкахвядерномматриксевыделяютсяидругиекомпоненты, такиекак ядрышко в виде особой электронно-плотной зоны, различные гранулы. Однако они не являются особыми органеллами и являются продуктами активности отдельных локусов хромосом. Так, ядрышко - это область синтеза рибосомальной РНК.

Основная функция ядра - хранение и репликация большей части наследственного материала. В ядре осуществляется контроль синтеза

12

нуклеиновых кислот, происходит формирование новых мембран на нуклеолемме, контроль деления или почкования клетки. При половом процессеядропоследиплоидизациипереходиткмейотическомуделениюи в половые споры включаются гаплоидные ядра. Вегетативные клетки разных видов дрожжей могут быть гаплоидными или диплоидными в зависимости от особенностей полового цикла развития.

При почковании дрожжевой клетки ядро обычно находится в области перешейка между материнской клеткой и почкой. При этом происходитегомитотическоеделениебезнарушенияцелостностиядерноймембраны. В делении участвует так называемая центриолярная пластинка (бляшка), которая удваивается и выполняет функции центриолей, организуя внутриядерный аппарат веретена.

Митохондрии лучше всего видны на электронных микрографиях в клетках дрожжей, выращенныхваэробныхусловиях (рис. 3). Онипредставляют собой разной формы органеллы, окруженные двойной мембраной. Этимембранынеидентичны. Внутренняямембранаобразуеткристы, скоторымисвязаныферментыокислительногофосфорилирования. Вматриксемитохондрийнаходятсяферментыциклатрикарбоновыхкис-

лот. Основная функция митохондрий - синтез АТФ в процессе дыхания.

В митохондриях имеется собственная митохондриальнаяДНК(мДНК), атакжевесь аппарат белкового синтеза, включая матричную РНК и 70S рибосомы (в отличие от 80S рибосом в цитоплазме). мДНК у дрожжей составляет 5-20% от всей ДНК клетки и кодирует некоторые ферменты митохондриального матрикса, например, цитохром-с оксидазу, комплекс АТФ-азы,

Рис. 3. Митохондриивдрожжевойклетке. ферменты процессинга РНК,

13

атакжесубъединицымитохондриальныхрибосом. Другиеферментымитохондриального матрикса импортируются в него из цитоплазмы и кодируются ядерной ДНК. Клетки, утерявшие вследствие мутаций часть или всю мДНК (так называемые petite-мутанты), образуют на плотных средах очень мелкие (petite) колонии, так как их рост происходит только за счет гликолиза, но не дыхания.

Числомитохондрийводнойдрожжевойклеткеварьируетвпределах 1-20 в разные периоды роста и в зависимости от условий. Как правило, 1-2 митохондрии в клетке более крупные, чем остальные и имеют разветвленную форму. Реконструкция ультратонких срезов клетки позволяет предположить, что в некоторых случаях (в подготовительный период почкования) клетка содержит всего одну вытянутую и сильно разветвленную митохондрию. Митохондрии способны к самовоспроизведению и никогда не образуются de novo.

Цитоплазматическая мембрана, или плазмолемма, окружающая дрожжевую клетку, играет роль барьера проницаемости и контролирует транспорт веществ в клетку и из нее. Кроме того, в состав мембраны входят ферменты, участвующие в биосинтезе клеточной стенки.

На поперечном срезе под электронным микроскопом мембрана у дрожжей выглядит как трехслойная структура. Она представляет собой два слоя фосфолипидов, в которые погружены белковые молекулы, то есть построена по общему для всех клеточных мембран принципу. Однако, имеются различия, касающиеся химического состава.

УSaccharomyces cerevisiae основнымифосфолипидамимембранявляются фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин (рис. 4). На их долю приходится около 90% всех липидов мембраны. В состав мембраны дрожжей входят также липиды стероидной природы - эргостерол, зимостерол и др. (рис. 5). Белки представленывосновномферментами, которыеучаствуютвтрансмембранном переносе веществ, расщеплении полисахаридов и синтезе внеклеточных структур.

Функции цитоплазматической мембраны многообразны: регуляция биосинтеза клеточной стенки, транспорт в клетку специфических молекул органических веществ, ионов K+ и Na+ и др.

14

Рис. 4. Фосфолипиды клеточной мембраны дрожжей.

Рис. 5. Стеролы клеточной мембраны дрожжей.

Эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи. Система внутриклеточныхмембран, разделяющихвнутреннеепространствоклетки на отсеки, носит название эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Часть этих мембран имеет гладкую поверхность (гладкий ЭПР), другие покрыты рибосомами (шероховатый ЭПР). ЭПР принимает участие в синтезе макромолекул (гликогена, белков) и во многих других клеточ-

15

ныхпроцессах. ИзмембранЭПРобразуютсяпузырькивезикулы, которые содержат ферменты, доставляемые в разные отделы клетки, например, к месту роста почки. Через ЭПР осуществляется связь между плазмолеммой и мембранами митохондрий.

Вмембраннойсистемедрожжевойклеткиможновыявитьпараллельно расположенные стопки (диски) мембран - диктиосомы - с функцией аппарата Гольджи. По периферии диски расширяются в виде валика и окружены пузырьками или звездчатыми фагосомами. Они выполняют экскреторные и секреторные функции, участвуют в образовании новых мембран и формировании стенок растущих клеток. Аппарат Гольджи - источник формирования особых везикулярных структур - лизосом. Это мембранныепузырькиоченьмелкиевакуолисгидролитическимиферментами, которые участвуют в освобождении клетки от чужеродных и собственныхнеобратимоповрежденныхсубклеточныхкомпонентов. При их разрушении освобождающиеся ферменты могут привести к полному лизису всей клетки, за что они и получили образное название - «мешки самоубийцы».

Вакуоли. В фазово-контрастном микроскопе в клетках дрожжей хорошовиднысветлыеипрозрачныеструктурыкруглойформы. Этовакуоли. Обычно их 1-3 в клетке. Каждая вакуоль окружена одинарной мембраной и содержит различные ферменты, липиды, низкомолекулярные продукты метаболизма (аминокислоты), ионы металлов. В вакуолях сосредоточена большая часть ионов калия. Иногда в вакуоли видны «пляшущие» засчетброуновскогодвиженияплотныегранулы. Этотакназываемыеметахроматическиегранулы, «пляшущиетельца» (dancing bodies), или волютин. Гранулы эти состоят из полимеризованных остатков фосфатов, а по периферии они покрыты комплексными соединениями из РНК, белков и липидов. Волютин - это резерв полифосфатов в клетке.

Основная функция вакуолей - разобщение процессов синтеза и распадабелковинуклеиновыхкислот. Онивыполняюттакжерольдеподля хранения некоторых запасных веществ и ферментов, участвуют в регуляции тургорного давления. Известны четыре пути транспорта внутрь вакуоли: пиноцитоз, транспортвпроцессерибосомногосинтеза, пассивный и активный транспорт.

16

Клеточнаястенка. Дрожжевыеклеткиокруженыригиднойструктурой - клеточной стенкой, которая защищает протопласт от осмотического разрыва и придает клетке определенную форму. Она составляет от 10 до 30% сухой биомассы дрожжей. При длительном замедленном росте ее доля увеличивается, при быстром - уменьшается. Клеточная стенка дрожжейсостоит восновномизполисахаридов снебольшимвключением других веществ - белков, липидов. В гидролизатах клеточных стенок аскомицетовых дрожжей доминируют три моносахарида: D-глюкоза, D-манноза и N-ацетил-D-глюкозамин, из которых и построены основные полимеры клеточной стенки - β-глюкан, α-маннан и хитин. В гидролизатах разных дрожжей встречаются и другие моносахариды: D-галактоза и D-глюкозамин у аскомицетовых дрожжей, L-фукоза и L-ксилоза - у базидиомицетовых. Хитин аккумулируется в основном в почечных рубцах.

Детальная картина организации клеточной стенки всего разнообразиядрожжейещенесовсемясна. Наиболееполноизученостроениеклеточной стенки у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Основной структурный компонент клеточной стенки, ответственный за ее ригидность - полисахарид β-глюкан. Он образует микрофибриллярную сеть непосредственно вокруг цитоплазматической мембраны. Структурные маннопротеиды в комплексе с белками образуют аморфный внешний слой. Эти дваслояразделеныпромежуточнымслоемсповышеннымсодержанием белков. Маннановые цепи обычно прикреплены к остаткам аспарагина или серина в белке. Маннан может использоваться клеткой в качестве резервного источника углерода, поэтому его содержание значительно колеблется в зависимости от условий роста.

На срезах клеток в электронном микроскопе клеточная стенка аскомицетовых дрожжей имеет внутренний светлый слой и внешний, более тонкий темный электронно-плотный слой, соответствующие глюкановому и маннановому каркасам. У базидиомицетовых дрожжей, клеточная стенка состоит главным образом из разного типа глюканов, и на срезевиднатонколамеллярнаяструктурабезчередованиятемныхисветлых слоев (рис. 6). Этот признак имеет таксономическое значение при определении аффинитета у несовершенных дрожжей.

17

Рис. 6. Клеточная стенка различных дрожжей под электронном микроскопом: 1 – аскомицетовые, 2 – базидиомицетовые.

Глюканклеточнойстенкиаскомицетовыхдрожжейрастворяетсяпод действиемклеточногосокавинограднойулитки. Гепатопанкреатический секрет улитки содержит более 30 различных ферментов и давно используется в исследованиях для разрушения клеточных стенок дрожжей и получения протопластов. У базидиомицетовых дрожжей протопластов при такой обработке не образуется.

Капсула. Клеткимногихвидовдрожжейобразуюткапсулу - слизистый полисахаридный чехол вокруг клетки. Капсула прозрачна и увидеть ее в световой микроскоп можно только после окраски препарата методомнегативногоконтрастирования. Дляэтогопрепаратыизкультурдрожжей готовят в растворе туши или другой мелкодисперсной взвеси. Мелкие частицы не проникают в плотную капсулу и они видны в виде светлых ореолов вокруг клеток на темном фоне. При подготовке препаратов к электронной микроскопии капсулы высыхают и превращаются в отдельные тяжи (рис. 7). Способность к образованию капсул особенно характерна для тех дрожжей, которые обитают на твердых поверхностях - на листьях растений, в почве. Этот слой может быть очень тонким (микрокапсула), ноиногдаеготолщинапревышаетдиаметрклеткив2-3 раза. Размеры капсулы зависят от вида дрожжей и условий среды обитания.

Состав внеклеточных капсульных полисахаридов варьирует в зависимости от вида дрожжей. Соединения, образующие капсулу, могут относиться к следующим группам.

18

Рис. 7. Капсулы дрожжей при различных способах микроскопирования: 1 – световой микроскоп, негативное контрастирование тушью, 2 – сканирующий электронный микроскоп, 3 – просвечивающий электронный микроскоп.

1.Фосфоманнаны - синтезируются некоторыми аскомицетовыми дрожжами рода Pichia и образуют тонкий слой на поверхности клеточной стенки. Эти соединения представляют собой олигосахаридные цепочки α (1→3) маннозы, соединенные между собой фосфоэфирными связями.

2.α-Глюканы, к числу которых относится пуллулан, образуемый дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans. Он представляет собой полимер, в котором мальтотриозные блоки связаны между собой

α(1→6) гликозидной связью.

3.β-Маннаны - образуются пигментированными дрожжами из родовRhodotorula, Sporobolomyces. Онипредставляютсобойлинейныеполимеры маннозы с чередующимися β (1→3) и β (1→4) связями.

4.Гетерополисахариды - характерны для многих несовершенных дрожжей базидиомицетового аффинитета из рода Cryptococcus, а такжеаскоспоровыхдрожжейLipomyces. Гетерополисахаридыкриптококков и липомицетов очень разнообразны по составу и строению. Обычно они имеют разветвленную структуру и могут состоять из остатков глюкуроновой кислоты, галактозы, глюкозы, маннозы, ксилозы, фукозы. У некоторых видов в основную цепь капсульных полисахаридов входят уроновые кислоты.

Функции капсулы многообразны. Капсулы способствуют прикреплению клеток к поверхности твердого субстрата, создают особую межклеточную среду, способствуют улучшению водного снабжения клетки.

19

Капсула может также участвовать в питании клетки. С одной стороны, клетка может использовать свои капсульные полисахариды в качестве резервного источника питания, с другой - полисахаридная слизь капсулы может адсорбировать питательные вещества, которые потребляются клеткой. В природных средах капсулы могут служить местами аккумуляции бактерий - спутников и ассоциантов дрожжей.

Цитоплазма. Основное вещество цитоплазмы составляет так называемый матрикс, в котором расположены все органеллы клетки. Матрикс содержит большое количество рибосом, полифосфатов, запасные углеводы - гликоген и трегалозу, многие ферменты и циклическую ДНК. Рибосомальная РНК составляет более 85% от общей суммы рибонуклеиновых кислот, содержание которых в 50-100 раз превышает концентрацию ДНК и достигает 12% от сухой массы дрожжевых клеток.

В цитоплазматическом матриксе, примыкающем к плазмолемме, обнаруживаютсясильнополимеризованныеполифосфатыввидегранул волютина. Это резерв энергетического материала, используемого в различных процессах метаболизма.

Гликоген - основной запасной полисахарид дрожжевой клетки - на ультратонких срезах имеет вид мелких сферических гранул диаметром около 40 нм. Он представляет собой сильноразветвленный полимер α-глюкозы, вкоторомглюкозныеостаткиосновнойцеписвязаныα(1→4), а остатки ветвей - α (1→6) связями. При обработке клеток раствором Люголя места скопления гликогена окрашиваются в темно-бурый цвет. На ультратонких срезах гликоген выявляется в виде мелких гранул диаметром около 40 нм.

Другой запасной углевод клетки - трегалоза - заключен в мелкие везикулы (трегалозосомы), окруженные мембраной, что защищает его от ферментативного гидролиза трегалазой, находящейся в цитоплазме. Кроме трегалазы в цитоплазме обнаруживаются многие другие ферменты: мальтаза, целлобиаза, лактаза (у тех дрожжей, которые ассимилируют эти углеводы), алкогольдегидрогеназа, все ферменты гликолитического пути и пентозофосфатного цикла.

Липиды. Вцитоплазмемогутнакапливатьсясвободныежирныекислотыввиделипидныхскоплений. Всоединениисфосфатамиибелками они образуют фосфолипидные или фосфолипопротеидные гранулы, ко-

20