Серологическая идентификация вируса.

РГА. Наиболее часто используется в диагностической практике. Для этой цели берут фекалии в первые дни заболевания (1 – 4-й дн), так как позднее уже образуются AT; готовят гомогенат на забуференном физрастворе с рН 6,6 – 6,8 в соотношении 1:5, центрифугируют при 3 – 5 тыс. мин^-1 (лучше 8 – 10 тыс. мин^-1). Надосадочную жидкость используют в РГА. По­следнюю ставят на том же забуференном р-ре с эритроцитами свиней (0,5 – 1%-ная взвесь) при 2 – 4°С. Учет производят через 1 – 1,5 ч. Необходимо выбрать донора эритроцитов, так как около 30% эритроцитов свиней обладают спонтанной агглютинацией. Для выявления ГТВС предложена гемагглютинация с формалинизированными эритроцитами свиней. Во время пика болезни в РГА исследуют пробы фекалий и сыворотки крови. Фекалии разводят 1:64 фосфатным буферным р-ром с добавлением солей MgCl₂ и СаС1₂. Воспроизводимые результаты РГА получают, если вместо ФБР или барбитурового буфера использовать для разведения АГ боратный солевой буфер, а для эритроцитов свиньи - 0,15М NaCl на 0,ЗМ фосфатном буфере. Наиболее высокие титры ГТВС регистрируются при рН 6. ГА агент идентифицируют с помощью РТГ А.

ИФ. В качестве высокоточного и специфичного теста предложена ИФ мазков-отпечатков слизистой оболочке кишечника. Описана методика ускоренной диагностики на основе ИФ. В ИФ идентифицируют ПВС, выделенный в культуре клеток.

РТГА. Ее ставят общепринятым методом в микро- и макровариантах с 4-8 ГАЕ вируса при 4°С. Используемые сыворотки инактивируют 1 ч при 56°С и обрабатывают эритроци­тами свиней (на 1 мл сыворотки 2-3 капли осадка эритроцитов, выдерживают при периоди­ческом встряхивании 2 ч при 4°С, затем центрифугируют 10 мин при 1000 мин^-1). Далее сыворотки обрабатывают каолином (25%-ную суспензию каолина на забуференном р-ре рН 6,6 – 6,8 добавляют в равном объеме к сыворотке, выдерживают 30 мин при комнатной тем­пературе, периодически встряхивая, затем центрифугируют), после чего их используют в РТГА. Если стандартная гипериммунная сыворотка нейтрализует ГА-активность вируса в разведении 1:8 или 1:16, результат считают положительным, РГА с последующей РТГА дают возможность быстро и точно поставить диагноз.

РНГА. РНГА предложена для выявления и идентификации вируса в фекалиях больных собак. Пробы фекалий, суспендированных в 10%-м барбиталовом буфере, центрифугирова­ли 15 мин при 2000 мин^-1, а надосадочную жидкость - при 4000 мин^-1 также 15 мин.

ИФА. Чувствителен и специфичен при диагностике парвовирусной инфекции собак. С помощью метода сэндвич-ELISA удается обнаруживать парвовирусный антиген в фекалиях собак.

Идентификация с помощью монАТ. Применял их C. Parrish и др. получили доказательства небольшого АГ различия между ПВС, вирусами энтерита норок и панлейкопении кошек, а также между 2-мя последними вирусами. Для выявления специфического АГ в пробах фекалий используют EL1SA с применением монАТ к 2-м эпитопам ГА-белка ПВС. Метод позволяет выявлять вирус в течение 15 мин инкубирования. Результаты учи­тывают визуально. Сочетание метода монАТ с ELISA в 87,9% случаев коррелировало с результатами РН и РТГА. Для проведения исследований ELISA требуется всего лишь 10-15 мин. ИФА основан на использовании специфических к ПВС монАТ, узнающих различные эпитопы ГА ПВС и нейтрализующих вирус. При сравнении с РГА сэндвич-вариант ИФА оказался более специфичным, чувствительным и легким в выполнении (51), Разработан простой и специфический метод идентификации вируса в фекалиях, основанный на ПЦР. Для удаления веществ, ингибирующих ПЦР, экстракты фекалий подвергают гельфильтрации. Чувствительность ПЦР составляет I0³ БОЕ/г свежих фекалий, тогда как чувствитель­ность ИФА и выделения вируса в культуре клеток - 10⁶ БОЕ/г.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В сыворотке крови щенков через 4 дня после появления клинической картины болезни титры анти-ГА колебались от 1:5000 до 1:16000, что свидетельствовало о наличии быстрого AT ответа на парвовирусную инфекцию собак. По дан­ным Klingeborn и др., при остром течении болезни титр анти-ГА составлял 1:320 – 1:20480. Обычно сыворотки крови в РТГА считают положительными, начиная с разведения 1:160 и выше. Через 4-7 дн после заражения у инфицированных собак в сыворотке крови в высоком титре обнаруживали ВНА и тормозящие гемагглютинацию AT, уровень которых практически не снижается в течение 2 лет. Для серологической диагностики ПВИСоб используют шт.SP-80, размноженный в культуре легочных клеток кошки. В реакции обыч­но используют эритроциты свиней, фиксированные 3%-ным р-ром формальдегида. Разбави­телем для эритроцитов, АГ и сыворотки служит 0,01 М р-р фосфатного буфера, рН 6,8, со­держащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина. Неспецифические анти-ГА удаляют прогреванием сыворотки 30 мин при 56°С и адсорбируют свиными эритроцитами. У реконвалесцентов титр анти-ГА 1:1280 – 1:2560 обычно держится около года и такие живот­ные иммунны к повторному заражению.

РНГА. В 70% случаев уровень титров AT составлял 1:256-1:4098.

РН. Ее чаще ставят в культуре клеток почки котенка, результаты учитывают ИФ, по­скольку вирус не проявляет ЦПД. Чувствительности и воспроизводимости достигают, ис­пользуя для постановки стандартный ПВСоб, имеющий низкое отношение ГА единиц к ин­фекционным (флюоресцирующим) единицам.

ВИЭФ. Применяют для выявления AT. Линии преципитации образуют все сыворотки с титром в РТГА 1:40 и выше, причем с помощью ВИЭФ AT обнаруживают чаще, чем в РТГА. Метод оказался ценным тем, что позволил выявить антитела к парвовирусу собак в экстрактах фекалий, причем дополнительной обработки экстрактов, необходимой при постановке РТГА, в этом случае не требуется.

Твердофазный ИФА (ELISA). С его помощью у щенков можно выявлять материнские AT и определять уровень поствакцинальных антител.

Дифференциальная диагностика. ПВИСоб следует дифференцировать от алиментар­ного и паразитарного гастроэнтеритов, чумы, при которой бывает очень высокая температу­ра тела, конъюнктивитов, ринитов и поражений ЦНС. Кроме того, ее следует отличать от вирусного гепатита и коронавирусной инфекции собак.