Хроматография

Хроматография - это метод установления химического состава смеси, основанный на определенном распределении веществ, находящихся в разном агрегатном состоянии (газ, жидкость, твердые частицы) между двумя фазами (подвижной или неподвижной). К подвижной фазе относятся газы и жидкости, а к неподвижной - твердые вещества. В определенных условиях вещества в смеси начинают распределяться по фазам: газы перемещаются вверх, твердые частицы осаждаются, между ними скапливается слой жидкости, некоторые жидкости тоже могут расслаиваться. Вещества подвижной фазы перемещаются с различной скоростью, что тоже позволяет судить о составе смеси. Распределяясь в анализаторе по фазам, компоненты смеси образуют цветовой столб, при этом для каждого вещества существуют свои цветовые характеристики. Основоположник метода - русский биолог М. С. Цвет, который, пропуская смеси красящих веществ растительного происхождения через бесцветное впитывающее вещество, обнаружил, что оно окрашивается слоями с различными цветовыми характеристиками. Такой цветовой столбик был назван хромограммой. В настоящее время существуют множество видов хроматографии. Например, адсорбционная хроматография основана на использовании адсорбентов (твердых впитывающих веществ). Разные вещества впитываются адсорбентами по-разному, именно выявление этих особенностей и позволяет оценить качественный состав исследуемой смеси. Распределительная хроматография основана на разной растворимости веществ, находящихся в разной фазе. Ионообменная хроматография основана на проникновении ионов подвижной фазы (исследуемой жидкости) в вещество неподвижной фазы, которое происходит за счет электростатического взаимодействия между ионами этих веществ. Способность твердых веществ выпадать в осадок позволяет проводить осадочную хроматографию. Существует еще эксклюзионная хроматография, при которой распределение веществ обеспечивается за счет разной проницаемости молекул жидкой фазы в гель (неподвижную фазу).

Электрофорез

Биохимические анализы, основанные на принципе электрофореза, в медицинской практике используют очень широко, так как одновременно информативны и экономичны. Метод электрофореза, разработанный в 1937 г. шведским биохимиком А. Тиселиусом, позволяет разделять макромолекулы по фракциям и основан на свойствах макромолекул при растворении в воде приобретать электрический заряд. При воздействии на раствор электрического поля молекулы притягиваются к электроду с противоположным зарядом. Скорость перемещения молекул зависит от их размера и электрического заряда. Так, молекулы белка амфотерны, т. е. имеют положительный заряд на одном конце и отрицательный на другом, поэтому их скорость и направление перемещения зависят от среды (кислая или щелочная). На заряд белковых молекул в средах с одинаковой кислотностью влияют аминокислоты, входящие в их состав. При распаде белковой молекулы образуются цепи аминокислот с разным электрическим зарядом, которые под воздействием электрического поля притягиваются к противоположно заряженному электроду и таким образом разделяются. Гель - это смесь нескольких веществ, обладающая свойствами твердых тел (сохраняет форму), но очень пластичных (деформируется). Одно вещество при этом всегда состоит из крупных молекул, образующих сетку (каркас), заполненную молекулами малого размера второго вещества. Для упрощения разделения веществ электрофорез проводят на фильтровальной бумаге, целлюлозе, гелях и агарозе, в этом случае гели выступают в качестве ионного фильтра: мелкие ионы проникают в поры геля, а крупные - нет, что дает дополнительную информацию для исследования. Наиболее часто электрофорез применяют для разделения белков по фракциям (все белки крови подразделяются на альбумины и несколько видов глобулинов). При многих заболеваниях изменяется не только общее количество белка в крови, но и соотношение его различных фракций. Результаты таких исследований важны для диагностики заболеваний печени, почек, злокачественных опухолей, нарушений иммунитета, инфекционных заболеваний и наследственных болезней.