7.7. Технологія роботи з ембріонами

Зібрану в скляний циліндр під час вимивання ембріонів промивну рідину накри­вають алюмінієвою фольгою, передають у стерильний бокс, де ставлять на півгоди­ни в термостат для відстоювання. Для уникнення забруднення промивної рідини та ембріонів у багатьох зарубіжних центрах всі маніпуляції з ембріонами проводять під ламінарною течією відфільтрованого повітря у спеціальних шафах, де низхідні течії стерильного повітря перешкоджають проникненню мікрофлори.

Після відстоювання промивної рідни відсмоктують за допомогою сифону її верх­ній шар, а залишених на дні 50-100 мл розливають обережно по 20-30 мл у чашки Петрі, дно яких для зручності розкреслено на квадрати, розміром 1 х 1 см, і досліджу­ють під стереоскопічним мікроскопом (МБС-9) чи бінокулярною лупою при 15-25-кратному збільшенні.

Досліджуючи уважно промивну рідину під мікроскопом, намагаються перш за все "виловити" в ній усі ембріони та незапліднені яйцеклітини і перенести їх у маленьку чашку Петрі для детальної оцінки і дальшої роботи з ними.

Оцінюючи стан кожного ембріона, звертають увагу на: відповідність стадії роз­витку ембріона його віку; форму прозо­рої оболонки та її цілість; рівномірність дроблення бластомерів; стан цитоплазми; прозорість перивітелінового простору.

Біологічно повноцінні ембріони мають гітку кулясту форму, прозору гомогенну цитоплазму, непошкоджену прозору обо­лонку, однакового розміру бластомери з щільним міжклітинним комплексом. Емб-

ни, що містять різних розмірів бласто-ври з нечіткими клітинними мембранами п іншими ознаками дегенерації, вважа-к ться неповноцінними.

Рис. 46. Ранні стадії розвитку ембріона ве-

ії рогатої худоби:

иезапліднсна яйцеклітина та спермій (ПО- прозора : знка, Ж-жовткова оболонка, 1ПТ — перше напрямне

іьце. С - спермій); 2) зигота, 1-й день розвитку (ПВП -ксивітсліновий простір); 3) 2-й день, ембріон на стадії 1- ітастомерів (Б); 4) 2—3-й день, 4-клітинна стадія роз-• —•-. ембріона; 5) 3—4-й день, 8-клітинна стадія; 6) 5-б-й існї. морула; 7) 6-7-й день, рання бластоциста (ПБ - по-т>:~книна бластоцисти); 8) 7—8-й день, експандована блас--мінста (Е - ембріобласт, Тр - трофобласт); 9) 8-9-й Х'-ь. бластоциста на стадії вилуплення; 10) 9—11-й день, нелуплена бластоциста; 11) 12-й день, пізня бластоциста;

1 - 4-й лень, видовжений бластодермічний міхурець.

219

Розділ

Вище наводились основні риси ембріона на ранніх стадіях його розвитку. Ці риси слід чітко пам'ятати і по них оцінювати "вік" ембріона, його повноцінність. При ви­миванні ембріонів з яйцепроводів практично всі вони бувають на стадії ранньої мору-ли, тоді як при вимиванні ембріонів з рога матки більшість з них буває на стадії ран­ньої бластоцисти. Внаслідок деякої розтягнутості суперовуляції тут можуть зустріча­тися і морули, і пізні бластоцисти, і незапліднені яйцеклітини в стані дегенерації (зі зморщеною, нерівної форми цитоплазмою), і, нарешті, зародки неправильної форми, з порушеннями цілості прозорої оболонки, її розривами, розшаруваннями, стисненою порожниною, нерівномірним дробленням, порушеннями міжклітинних зв'язків, гра­нуляцією протоплазми. Відправною рискою при оцінюванні ембріонів є день цикл). на який проводиться вимивання, і типічні для даного "віку" риси ембріона.

Ембріони, що різко відстали у своєму розвитку, з вираженими ознаками асинхрон-ності дроблення бластомерів, їх дегенерації непридатні для трансплантації, тоді як ембріони з незначними морфологічними змінами вважаються умовно придатними.

Значно більші зміни спостерігаються у збережених у замороженому стані ембріо­нів, тому оцінка їх буває важчою.

Існує декілька підходів до оцінки ембріонів. Греве пропонує оцінювати їх за таки­ми показниками: життєздатні - ембріони, стадія розвитку яких співпадає з їх віком, що відраховується, починаючи з дня осіменіння; сповільнені (ретардовані) - ембріо­ни, які виявляються на дещо ранніх стадіях розвитку, ніж очікувалося в зв'язку з їх віком; вироджені (дегенеровані) - ембріони з різними ознаками дегенерації.

Райт класифікує ембріони за морфологічними ознаками на: нормальні; ембріони з незначними відхиленнями; ембріони із збільшеною кількістю дегенерованих клітин.

М. І. Сергєєв та Ф. І. Осташко запропонували 5-бальну систему оцінки ембріонів за морфологічними ознаками.

Проте на підставі морфологічної оцінки ембріонів важко зробити висновок про їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування і від при­живлення їх в розі матки. На жаль, точніших, а головне - доступних для виробництва методів поки що немає.

В сумнівних випадках можна залишити вимиті ембріони в невеликій кількості по­живного середовища на 30-40 хв. в термостаті для діагностичного культивування.

Короткотермінове збереження та культивування ембріонів. Від видобування ембріонів у донорів до пересаджування їх реципієнту проходить звичайно не менше З годин. Протягом цього часу потрібно зберегти життєздатність ембріонів.

Для цього ембріон можна помістити в 0,5 мл середовища на годинниковому скель­ці, поставити його в стерильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим фільтруваль­ним папером, накрити і поставити в термостат з температурою 37 °С.

Для більш тривалого зберігання ембріона (у відповідному середовищі в ампулах, поліхлорвінілових пайетах для осіменіння) засмоктують ембріон в пайету таким чи­ном, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці довжиною 1-1,5 см. Закри­вають кінці пайети стальними кульками чи поліетиленовими корками і поміщають в

220

Трансплантація ембріонів

термостат при 37 °С чи під шаром стерильного вазелінового масла на годинниковому склі чи у пробірці,

В таких умовах біологічно повноцінні ембріони можуть зберігатися до 24^8 го­дин, але в практичних умовах культивування при 37 °С застосовують лише як виму­шений короткочасний захід.

В кінці культивування обов'язково перевіряють під мікроскопом життєздатність ембріонів.

Одним з прикладів успішного зберігання ембріонів при температурі тіла є досліди кембріджських вчених по пересаджуванню ембріонів овець у яйцепроводи кролиці, які дозволили здійснити ряд міжконтинентальних перевезень ембріонів з послідую-чою їх ретрансплантацією. Після хірургічного пересаджування таких ембріонів отри­мано нормальних нащадків.

Можна також зберігати ембріони при знижених плюсових температурах, що ви­кликають зворотне гальмування метаболічних процесів.

Кріоконсервування ембріонів. Ще в 1953 р. О. Сміт вперше вдалося заморозити ембріони кролика, проте для перенесення цих дослідів на сільськогосподарські тва­рини потрібно було біля 20 років.

Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є ран­ня бластоциста, овець і кіз - пізня морула чи рання бластоциста, свиней - бластоцис­та; краще переносять заморожування свіжі ембріони.

Заморожування та розморожування ембріонів може супроводжуватися кристалі­зацією води в бластомерах та концентрацією розчинених речовин у рідкій фазі. Ці два процеси можуть проявлятися одночасно, хоча кристалізація більш виражена при відносно швидкому, а осмотичні зміни - при повільному заморожуванні.

Слід підкреслити, що процес заморожування ембріонів є набагато складнішим від івморожування сперми, оскільки ембріони є багатоклітинними утвореннями. Тому д> же важлива роль відводиться підготовці ембріонів до заморожування, їх захисту від температурних та осмотичних пошкоджень.

В процесі заморожування ембріонів спочатку знижується температура в навколо-клітинному середовищі, тут поступово збільшується кількість льоду, тоді як в решті розчину зростає концентрація солей.

Виникає таким чином різниця осмотичного тиску між позаклітинною та внутріш­ньо-клітинною фазами, яка може бути зрівноважена шляхом віддачі клітинами води в позаклітинне середовище.

Для уникнення кристалізації внутрішньоклітинної води до складу середовища до­лають кріопротектори диметилсульфоксид (ДМСО) чи гліцерин, а щоб не допустити осмотичних зрушень - штучно стимулюють кристалізацію на певній стадії. Проте нме введення до складу середовища з ембріонами кріопротектора, як і його видален­ню, може викликати осмотичні зрушення. Тому, це насичення (еквілібрацію) роблять о: ступово, поміщаючи ембріони на годинникових стеклах в чашках Петрі спочатку В 5-Ю хв. у 0,25 М розчин ДМСО, тоді - в 0,5 М, 1,0 М і нарешті - 1,5 М розчин.

221

Розділ 7

В останньому розчині ембріони витримують 15-20 хвилин. Якщо кріопротектором служить гліцерин, то спочатку ембріони поміщають на 10 хв. у 3,3 %-ий його розчин, тоді на 14 хв. у 6,6 %-ий і в кінці на 30 хв. у 10 %-ий розчин. Після розморожування ембріонів їх також відмивають від кріопротектора, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією кріопротектора в менш концентровані розчини.

Закінчивши насичення ембріонів кріопротектором їх розфасовують по пробірках, ампулах чи пайетах для заморожування, яке проводять одно- чи двоетапним методом. повільно чи швидко. В пайети ембріони поміщають в такій послідовності: середови­ще - повітря - середовище з ембріоном - повітря - середовище. Кожен стовпчик по­винен займати в пайеті біля 1-2 см довжини. Один край пайети закривають зволоже­ним корком.

Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін, за 4-5 °С до початку льодоутворення стимулюють кристалізацію, додаючи до розчину зернин}" льоду, кристалик йодистого срібла чи просто переохолоджений предмет (проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і швидко торкаються ним поверхні рідини).

Повільне заморожування і повільне розморожування ембріонів. Охолоджу­ють ембріони від 20 °С до -7 °С зі швидкістю 1 °С/хв., викликають кристалізацію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 °С/хв. до -36 °С далі - зі швидкістю 0,1 °С/хв. до -60 °С і переносять в рідкий азот.

Розморожують ембріони в спиртовій бані - скляній циліндричній колбі з температу­рою -50 °С, куди поміщають пробірки чи ампули з ембріонами і розморожують зі швид­кістю 4 °С/хв. до 10 °С, після чого переносять на 5 хв. у водяну баню з температурою 20 °С. Нарешті, переносять ембріони в середовище для видалення кріопротектора.

Швидке заморожування та розморожування ембріонів. Охолоджують ембрі­они у міні-пайетах - від 20 °С до 7 °С зі швидкістю 1 °С/хв., викликають кристаліза­цію і тоді охолоджують зі швидкістю 0,3 °С/хв. лише до -30 °С і переносять в рідкий азот. Розморожують ембріони у водяній бані з температурою 37 °С протягом ЗО сек. зі швидкістю 3,0 °С/хв.

НДІ тваринництва Лісостепу і Полісся УРСР запропонував свою технологію за­морожування ембріонів: свіжовимиті ембріони переносять на 10 хв. в 0,5 М розчин ДМСО на середовищі ФБС, тоді на 20 хв. в таке ж середовище з 1,3 М ДМСО, після чого, по 3—4 зародки переносять в уленгутівську пробірку з 0,5 мл 1,0 М ДМСО на ФБС, герметизують пробірку і поміщають у програмний апарат для охолодження і заморожування.

Заморожування ведуть за такою програмою: від 22-25 °С до 6 °С зі швидкістю 1 °С/хв., штучно збуджують кристалізацію середовища і заморожують від -7 °С до -40 °С зі швидкістю 0,3 °С/хв., від -40 °С до -60 ° С - зі швидкістю 0,1 °С/хв., після чого переносять пробірки з охолодженими до -60 °С ембріонами в рідкий азот.

Останнім часом запропоновані технології заморожування ембріонів у соломин­ках, які містять одночасно два середовища - для заморожування (рідина Дюльбекко з

222

'зансплантація ембріонів

[О %-им гліцерином і поміщеним в ній ембріоном) і середовище для розморожування рідина Дюльбекко з 20 % фетальної сироватки і 0,5 М розчином сахарози). Після розморожування соломинку струшують (для змішування середовищ), витримають на 10-20 хв. при кімнатній температурі і пересаджують ембріон реципієнту.

При заморожуванні ембріонів необхідно суворо дотримуватися технології. За­морожування ембріонів дозволяє значно вдосконалити організацію трансплантації і зідпадає потреба утримання великої кількості реципієнтів і термінового пересаджу­вання вимитих ембріонів. Замість цього можна створювати банки ембріонів, прово­дити трансплантацію розморожених ембріонів реципієнтам після спонтанної охоти, проводити їх експорт та імпорт.