Типы репликации кольцевых днк

Рис. 4.2

В кольцевых молекулах ДНК репликационный глазок образует -структуру. Приведены две проекции реплицирующейся кольцевой ДНК. Символом ori обозначена точка начала репликации, стрелками показано направление репликации.

Рис. 4.3

Репликационный глазок увеличивается по мере продвижения репликативных вилок вдоль репликона (Lewin B., Genes III, New York, Wiley, 1987).

Репликация по типу катящегося кольца

До сих пор мы рассматривали возможность репликации в одном или двух направлениях, когда одновременно синтезируются обе новые цепи ДНК. Как в линейной, так и в кольцевой молекуле ДНК (например, у E. coli) движение репликативной вилки (или вилок) формирует глазок. Если матрицей служит кольцевая ДНК, реплицирующаяся молекула принимает форму -структуры.

Однако возможен и другой вариант репликации кольцевой молекулы ДНК. В этом случае двухцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте только одной цепи, и к образовавшемуся в результате надреза 3`-OH-концу с участием ДНК-полимеразы  присоединяются дезоксинуклеотиды. Вследствие того, что матрицей служит интактная замкнутая цепь ДНК, в вилке синтезируется только лидирующая цепь [8]. По мере синтеза лидирующей цепи происходит вытеснение 5^/-конца исходной надрезанной родительской цепи (рис. 4.10).

Такой тип структуры получил название катящегося кольца, поскольку точка роста скользит вокруг кольцевой матричной цепи. Так как вновь синтезируемый материал ковалентно связан с исходным материалом, вытесняемая нить достигает больших размеров и содержит любое число единиц геномов, синтезируемых путем непрерывного вращения матрицы. Катящееся кольцо используется in vivo многократно. Для чего это нужно?

У фагов М13 или Х174, чьи зрелые геномы представлены одноцепочечными кольцевыми ДНК, указанный способ репликации используется на поздних стадиях инфекционного процесса, после того как геномная кольцевая ДНК превращается в двухцепочечную репликативную форму.

Постоянно отделяющиеся в результате репликации одиночные цепи ДНК приводят к образованию серии геномов (отдельные цепи могут включать от двух до пяти фаговых геномов), которые затем фрагментируются в каждой точке начала репликации и встраиваются в фаговые частицы в виде одноцепочечных замкнутых зрелых форм. Кроме того, возможно их использование в дальнейших циклах репликации.

Иногда освобождаемая отдельная цепь катящегося кольца может быть превращена в двухцепочечную ДНК путем синтеза комплементарной цепи, при этом образуются двухцепочечные конкатемерные молекулы, необходимые для созревания определенных фаговых ДНК, например, ДНК фага . Фаг  использует такой способ репликации при образовании своей линейной двухцепочечной геномной ДНК. На ранних стадиях инфицирования линейная вирусная ДНК превращается в кольцевую репликативную форму. Для образования линейной ДНК фагового потомства двухцепочечные кольца надрезаются и асимметрично реплицируются, как это происходит в случае ДНК фагов М13 и Х174. Однако вытесняемые одиночные цепи превращаются в двухцепочечные структуры (рис. 4.11).

Сначала во множестве сайтов вдоль одиночной цепи праймаза синтезирует короткие фрагменты РНК, которые используются ДНК-полимеразой III в качестве праймеров. Затем РНК удаляется с помощью ДНК-полимеразы I и бреши лигируются с участием ДНК-лигазы. При упаковке ДНК в фаговые частицы в специальных участках конкатемеров, называемых cos-сайтами и отстоящих друг от друга на длину вирусного генома, происходит разрезание. В результате длинные дуплексы многократно повторенной ДНК фага  расчленяются на фрагменты, соответствующие по размеру зрелой ДНК, обнаруживаемой в вирионах [9]. Следует отметить, что данный способ образования конкатемерных молекул ДНК не единственный. Такие молекулы образуются при размножении фага Т₄. Механизм катящегося кольца используется при образовании большого количества копий кольцевых молекул рДНК (кодирующих рРНК) в ооцитах Xenopus laevis.

Репликация с образованием D-петель

Особый тип поведения репликативной вилки идентифицирован в некоторых митохондриях (в первую очередь митохондриях млекопитающих). Репликация начинается в специфической точке начала репликации в кольцевой двухцепочечной молекуле ДНК.

Первоначально только одна цепь (H-цепь в митохондриях млекопитающих) используется как матрица для синтеза новой цепи. Синтез происходит только на коротком участке и вызывает вытеснение исходной комплементарной L-цепи, которая остается одноцепочечной. Данное явление было названо вытеснением (displacement), а образующаяся структура – D-петлей. В митохондриях млекопитающих единственная D-петля стабильна и состоит из 500-600 оснований. Синтез короткой цепи, имеющей уникальный 5^/-конец инициируется посредством образования праймерной РНК, а вариабельный 3^/-конец формируется, по-видимому, в результате терминации синтеза в любом из 3-4 дискретных сайтов. Праймер не достаточно стабилен и может деградировать, а затем синтезироваться заново для сохранения в локусе Ori_R двойной спирали в открытой форме.

1. Некоторые митохондриальные ДНК, например, у Xenopus laevis (шпорцевая лягушка) имеют одну большую D-петлю.

2. Другие ДНК могут иметь несколько D-петель. Например, в линейной митохондриальной ДНК Tetrahymena (инфузория) обнаружено шесть D-петель.

3. Такой же механизм репликации используется в хлоропластной ДНК, где у высших растений образуются две D-петли.

Репликация митохондриальной ДНК млекопитающих происходит посредством присоединения дезоксирибонуклеотидов к 3^/-концу короткой затравочной цепи, которая при этом удлиняется в D-петле. Вытесняемая часть L-цепи становится длиннее и расширяет D-петлю. Расширение продолжается до тех пор, пока не достигнет точки, находящейся на расстоянии 67% длины кольца. Удвоение этой области приводит к раскрытию точки начала репликации в L-цепи. В сайте Ori_D инициируется синтез Н-цепи, протекающий в противоположном направлении с использованием вытесненной L-цепи в качестве матрицы. Таким образом, раскрытие спирали не обязательно ведет к инициации репликации одновременно на двух материнских цепях ДНК. Структуры D-петель образуются в тех случаях, когда в кольцевых ДНК точки начала репликации двух цепей разделены некоторым расстоянием [10].

Из-за задержки в инициации репликации второй цепи ДНК, дочерняя H-цепь синтезируется только на 30-40% длины кольца к моменту завершения синтеза дочерней L-цепи. В результате освобождается одна полная двухцепочечная кольцевая ДНК и одна кольцевая молекула, содержащая брешь. Далее брешь заделывается и остающиеся разрывы сшивается с участием лигаз.