- •Окраска бактерий в мазках
- •Для обнаружения возбудителей используют различные методы и группы методов.
- •Окраска метиленовым синим Лефлера Методика окраски.
- •Окраска основным фуксином по Пфейферу
- •Окраска генциановым или метиловым фиолетовым
- •Окраска карболовым тионином Николя
- •Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру
- •Окраска по Граму Красящие растворы.
- •Красящие смеси для грамположительных бактерий:
- •Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:
- •Методика окраски.
- •Окраска по Романовскому-Гимзе Приготовление красителя
- •Методика окраски
- •Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза
- •Методика окраски «толстой капли».
- •Метод Френкеля
- •Флюоресцентное окрашивание мазков мокроты (метод Хагеманна) ,
- •Метод Киньуна (для срезов)
- •Метод Файта (для срезов)
- •Серебрение бактерий в мазках — метод Фонтана
- •Выявление жгутиков и ресничек Метод Леффлера
- •Метод Лайфзона
- •Метод Меллера
- •Окраска малахитовым зеленым Шеффера-Фултона
- •Метод Ожешки
- •Метод Битгера
- •Выявление возбудителей сыпного тифа и других риккетсий Выявление риккетсий в мазках (метод Маккиавелло)
- •Выявление риккетсий в срезах (метод Ника)
- •Выявление коринебактерий дифтерии
- •Выявление стрептококков
- •Выявление стафилококков
- •Выявление пневмококков
- •Выявление менингококков
- •Выявление гонококков
- •Выявление возбудителей чумы
- •Выявление анаэробных спорообразующих бактерий группы клостридии
- •Выявление возбудителей сибирской язвы
- •Выявление возбудителей кишечной инфекции
- •Выявление спирохет и других спиралевидных бактерий
- •Выявление возбудителей возвратного тифа
- •Выявление лептоспир
Окраска по Романовскому-Гимзе Приготовление красителя
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
Методика окраски
1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40—120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8 — 6,0, для мазка крови — 6,4 — 6,5, для выявления простейших — 6,8, малярийного плазмодия — 7,0 — 7,2.
2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный.
Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза
Фиксация и методика окраски те же, что и для мазков крови. Для исследования на присутствие плазмоидиев, кроме мазков, берут обязательно и так называемую «толстую каплю». Последняя представляет собой каплю крови, размазанную по предметному стеклу углом другого стекла. «Толстую каплю» перед окраской не фиксируют.
Методика окраски «толстой капли».
1. На высохшую каплю наливают краску Романовского-Гимза, разведенную как обычно. Продолжительность окрашивания 30-50 минут.
Вариант: нефиксированную толстую каплю сушат в течение 1 ч на воздухе и окрашивают 2—10 мин смесью из 4 мл раствора Гимзы, 3 мл ацетона, 2 мл буферного раствора (рН 6,5) и 31 мл дистиллированной воды.
2. Осторожно споласкивают в дистиллированной воде и затем просушивают в вертикальном положении (фильтровальную бумагу применять нельзя).
Препарат исследуют при иммерсии. Для сохранения препаратов можно закрыть толстую каплю покровным стеклом, которое кладут на водный раствор поливинилового спирта или раствор желатина.
Ввиду того, что гемоглобин в водных растворах краски выщелачивается, эритроциты в окрашенной капле не видны. Морфология паразита в толстой капле менее ясна, чем в мазке.
Результат. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, отчетливо видна голубая протоплазма паразитов с ядром, окрашенным в розовый или красный цвет. Форма паразитов в зависимости от стадии развития может быть различной. В зрелых плазмодиях определяются темно-коричневые пигментные включения. Паразиты находятся в эритроцитах, но могут располагаться и свободно.
Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)
Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые после окрашивания фуксином не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот и спиртов. Особенностью этой группы бактерий является их невосприимчивость к красителям, поэтому для их окрашивания применяют подогретые концентрированные красители. Наиболее распространен метод Циля-Нильсена.
Окраска микобактерий туберкулеза карбол-фуксином по Цилю-Нильсену
Приготовление красителя
Для приготовления раствора карболового фуксина 1 г основного фуксина растворяют в 2 мл глицерина и доливают до 100 мл 5 % раствором фенола. Р. Лилли (1969) рекомендует следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.
Методика окраски
1. Наливают на фиксированный мазок карбол-фуксин Циля (окрашивают через фильтровальную бумагу) и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживают в течение 1—2 минуты, не доводя до кипения.
2. Сливают краску, удаляют фильтровальную бумагу и основательно промывают в водопроводной воде.
3. Дифференцируют 1% солянокислым спиртом (на 70° спирте) до тех пор, пока мазок не примет бледно-розовый или бледно-фиолетовый тон (примерно 30—60 секунд).
4. Промывают в воде 15-30 и более секунд.
5. Докрашивают метиленовым синим Лефлера 15-30 секунд.
6. Основательно споласкивают в воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Мазки, перекрашенные метиленовым синим, можно дифференцировать 70° спиртом.
Такое простое окрашивание мазков на микобактерии туберкулеза практически имеет наибольшее значение. Наряду с ним, но значительно реже, применяются и другие способы: метод обогащения, посевы, прививки животным.
Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне.