3. Механизмы клеточной коаггрегации

Процесс адгезии микроорганизмов к субстрату завершается формированием на поверхности монослоя клеток, который впоследствии подвергается реорганизации и реструктурированию с образованием основных структурно-функциональных единиц биоплёнки – микроколоний [33]. Данный процесс получил название клеточная коаггрегация. Механизмы клеточной коаггрегации разнообразны и могут значительно различаться у разных видов микроорганизмов. Некоторые виды бактерий характеризуются наличием нескольких механизмов коаггрегации, которые включаются в зависимости от природы субстрата на котором формируется биоплёнка. Характерным для этого процесса является то, что, как и адгезия, в лабораторных условиях она начинается достаточно рано. Эксперименты с биоплёнками P. aeruginosa (рис. 7) показали, что формирование первых микроколоний наблюдается уже через 40-45 минут с момента начала контакта клеток с субстратом. В тоже время в культуральной жидкости за такой короткий промежуток времени засечь изменения оптической плотности практически не возможно.

Рис. 7. Клетки P. aeruginosa PA01на поверхности предметного стекла через 45 минут после начала инкубации. Видна формирующаяся микроколония(светлопольная микроскопия, окраска кристаллическим фиолетовым)*

Одним из важнейших механизмов обеспечивающих клеточную коаггрегацию является поверхностное движение у бактерий. На сегодня известны три типа такого движения:

1. Swarming motility (роение) – характерно практически для всех бактерий которые имеют жгутики. Обусловливает перемещение клеток по органическим субстратам значительной степени вязкости. Осуществляется за счёт жгутиков и биосурфоктантов.

2. Twitching motility («ходульная ходьба») – характерно для представителей семейства Pseudomonodaceae несущих фимбрии IV типа. Обеспечивает движения по любому типу твёрдых субстратов. Осуществляется за счёт сокращения фимбрии IV.

3. Gliding motility (скольжение) – характерно для миксобактерий и некоторых других микроорганизмов. Обеспечивает движение по любому типу твёрдых субстратов. Механизм окончательно не выяснен.

У P. aeruginosa ведущую роль в процессе реорганизации монослоя клеток в микроколонии играет twitching motility [30]. Этот тип движения обуславливает не только первичную коаггрегацию клеток в микроколонии но и вторичную колонизацию субстрата (рис. 8). Так, по мере созревания микроколоний, часть клеток, которые инициируют их формирование, оказываются в не благоприятных условиях и мигрируют из глубинных слоёв зрелых микрколоний на свободное пространство формируя вторичные микроколонии связанные с первичными зоной twitching motility.

Рис. 8. КлеткиP. aeruginosa PA01на поверхности предметного стекла через 45 минут после начала инкубации. Стрелками показаны первичная микроколония; вторичная микроколония; зона twitching motility (светлопольная микроскопия, окраска кристаллическим фиолетовым)*

Регуляция twitching motility у P. aeruginosa осуществляется с помощью локуса crc. Ранее белок СrC был известен в качестве катаболитного репрессора, который подавляет метаболизм сахаров у P. aeruginosa в присутствии органических кислот, тем самым переключая метаболизм бактерии с одного вида субстрата на другой, более предпочтительный источник углерода и энергии для этих бактерий. Однако, последующие исследования показали что СrC является также негативным регулятором биосинтеза компонентов жгутика и позитивным регулятором генов pilA и pilB, которые кодируют основной структурный белок фимбрий IV типа и фактор обеспечивающий их структуризацию [5, 31].

Важнейшую роль в процессе клеточной коаггрегации выполняют коаггрегативные адгезины и рецепторы к ним [33]. Лучше всего роль этих молекул описана у бактерий формирующих зубной налёт (рис. 9), в частности у бактерий родов Streptococcus, Actinomyces и Fusubacterium [20].

Коаггрегативные адгезины представляют собой группу сложных белков, различающиеся по своей химической структуре. Так, у Streptococcus gordoni найдены пять различных белков, участвующих в клеточной коаггрегации. Одним из них является белок массой 100 кДа использующий

Рис. 9 Схема коаггрегативных связей микроорганизмов в зубном налёте [33].

в качестве «стабилизатора» при взаимодействии с микроорганизмами-партнёрами молекулы липотейхоевой кислоты [2]. Этот белок в основном используется при внутриродовой коаггрегации. Вторым белком является лектиноподобный Нs-белок. Этот белок, с молекулярной массой 203 кДа ассоциирован с фибриллярными структурами и используется для взаимодействия с компонентами слюны, полиморфноядерными лейкоцитами и межвидовой коаггрегации [36,37]. Третий белок, СshA, с молекулярной массой 259 кДа представляет собой фибриллярный протеин, заякоренный в клеточную стенку и видимый при негативном окрашивании в электронный микроскоп как фибриллы длинной 70 нм [26, 27]. Этот белок содержит несколько аминокислотных повторов располагающихся на дистальном конце молекулы и использующийся S. gordonii для коаггрегации с клетками Actinomyces naeslundii [27]. Два других белка, названные SspA и SspB участвуют в коаггрегации с A. naeslundii и Porphyromonas gingivialis. [9, 13, 21]. SspA и SspB (также называемые антиген І/ІІ полипептиды) характеризуются полифункциональностью, и кроме коаггрегации так же учствуют в адгезии к фибринонектину, коллагену и гликопротеинам слюны [10]. Синтез данных белков индуцируется компонентами слюны [12].

Коаггрегативные адгезины у A. naeslundii находятся в комплексе с перитрихиально расположенными фимбриями. Так, один из таких адгезинов является белок с молекулярной массой 95 кДа, необходимый для нормальной работы фимбрий ІІ типа и, по-видимому, являющийся минорным белком этих структур [19]. Подобные коадгезины, заякоренные в клеточной стенке, вынесены на определённое расстояние от клеток микроорганизмов что улучшает контакт между партнёрами [19].

Fusobacterium nucleatum является центральным звеном в построении сообщества микроорганизмов зубного налёта. Этот микроорганизм синтезирует четыре различных многофункциональных коадгезина, которые обуславливают взаимодействие этой бактерии с семью разными видами микроорганизмов [35]. Одним из основных адгезинов у этого микроорганизма является N-ацетилнейраминоат-специфичный адгезин.

Среди коаггрегативных адгезинов бактерий, не являющихся частью зубного налёта, можно выделить адгезин Blastomonas natatoria. Этот белок с молекулярной массой около 70 кДа, имеет значительную степень гомологии с TonB-зависимым рецептором. Этот рецептор является характерным для многих видов грамотрицательных бактерий и опосредует высоко-афинное связывание железа [29]. Основываясь на этом, можно предположить, что TonB-зависимый рецептор способен выполнять роль коаггрегативного адгезина.

На сегодня, существует достаточно немного информации о строении рецепторов к коаггрегативным адгезинам. Однако проведённые исследования показывают, что их структурно-функциональное разнообразие, скорее всего, невелико [33]. Исследования, проведённые на бактериях рода Streptococcus показали, что процесс коаггрегации у этих микроорганизмов ингибируется лактозой, и каждый вид стрептококков ротовой полости имеет как минимум один основной полисахаридный рецептор [33]. Эти рецепторы, в основном представляют собой связанные фосфодиэфирными связями повторяющиеся последовательности гекса- и гептосахаридов [1, 40]. Исследование 22 штаммов стрептококков, для которых характерна галактозид-ингибируемая клеточная коаггрегация показало, что все шесть типов основных рецепторов построены по одному из двух принципов - GalNacβ1 – 3Gal или Galβ1 – 3GalNAc [1]. Вероятно, это связанно с тем, что основную роль в узнавании валидного для взаимодействия партнёра по коаггрегации играет структурное разнообразие адгезинов, тогда как рецепторы выполняют лишь механические функции.