Глава 2. Процесс формирования биоплёнки.
2.1. Основные стадии процесса формирования биоплёнки.
Образование биоплёнки микроорганизмами является сложным процессом, в который вовлекаются многие структуры и системы клеток микроорганизмов. Эксперименты с биоплёнками в лабораторных условиях позволили установить динамику этого процесса и выделить ряд последовательных стадий, которые сменяют друг-друга. Сегодня, в процессе жизни биоплёнки выделяют пять основных стадий, которые занимают разные (в зависимости от вида микроорганизмов образующих биоплёнки), однако, видимо фиксированные отрезки времени (рис. 4):
Стадия адгезии – первичная седиментация и прекрипление клеток к субстрату.
Стадия монослоя – формирование прикрепившимися клетками диффузного слоя на поверхности субстрата, начало структурно-функциональных перестроек.
Стадия микроколоний – аггрегация клеток и формирование основных структурно-функциональных едениц биоплёнки, запуск механизмов биосинтеза матрикса.
Стадия зрелой биоплёнки – формирование соответствующей архитектуры, реализация процессов межклеточной коммуникации и др.
Стадия распада – деградация матрикса биоплёнки, гибель клеток, или переход их к автономному существованию.
Время жизни разных биоплёнок может значительно варьировать. В лабораторных условиях при периодическом культивировании жизненный цикл моновидовых биоплёнок обычно равняется 18-24 дням. При постоянном культивировани с применением метода “проточных камер” жизненный цикл биоплёнок может удлиняться до нескольких месяцев. В природных условиях, в случае неограниченного поступления необходимых питательных веществ
Рис. 5. Основные стадии процесса формирования биоплёнки.
1) Адгезия; 2) Монослой; 3) Микроколонии; 4) Зрелая биоплёнка; 5) Распад биоплёнки.
биоплёнки микроорганизмов могут существовать неограниченный период времени. Характерной особенностью природных поливидовых биоплёнок является то, что у них смена указанных выше стадий является стёртой и не отграниченной во времени. Это связанно с тем, что в природных биоплёнках идёт постоянный процесс сукцессии, часто с заменой одних видов на другие и кардинальной перестройкой существующего сообщества. В этом смысле природные биоплёнки можно считать «бессмертными».
2.2. Адгезия
Формирования биоплёнки микроорганизмами начинается с процесса который получил название адгезия. Адгезия представляет собой процесс перехода от подвижного к прекреплённому способу существования. Этот процесс сопровождается седиментацией клеток на поверхности и последующим их закреплением на ней.
Наиболее полно процесс адгезии изучен у грамотрицательных бактерий. В лабораторных условиях процесс адгезии начинается практически моментально после нанесения клеток микроорганизмов в питательной среде на подходящую поверхность. В его осуществлении принимает участие ряд поверхностных структур этих микроорганизмов. Одну из ведущих ролей в процессе адгезии играют жгутики и фимбрии бактерий [5]. Роль этих компонентов была установлена с использованием так называемой группы sad мутантов P. aeruginosa [30]. Одна из групп таких мутантов, дефектная по жгутиковому движению, проявила так же отсутствие способности формировать биоплёнку. Это позволяет предположить, что бактериальные жгутики являются не только средством доставки бактерий к поверхности, но и играют важнейшую роль в процессе инициации взаимодействия бактериальных клеток с поверхностью.
Рис. 6. Клетки P. aeruginosa PA01на поверхности предметного стекла через 30 минут после начала инкубации (светлопольная микроскопия, окраска кристаллическим фиолетовым)*
*- авторские фотографии
Для E.coli, ведущую роль в процессе адгезии играют фимбрии I типа [15, 32]. Эти структуры несут основную нагрузку в процессе адгезии, однако, в отличие от сокращающихся фимбрий IV типа P. aeruginosa, они не обеспечивают осуществление поверхностного движения, и видимо не участвуют в следующей за адгезией стадии формирования микроколоний. Напротив, для P. aeruginosa фимбрии видимо играют лишь опосредованную роль в процессе адгезии, однако они являются ключевым фактором в процессе формирования микроколоний.
Роль жгутиков в процессе адгезии у E.coli остаётся до конца не выясненной. Исследования показали, что поведение мутантов по компонентам жгутика этого микроорганизма абсолютно отличается от описанных выше мутантов P. aeruginosa. Такие мутанты не только не теряют способность осуществлять адгезию (хотя она в некоторой мере и нарушается) но и проявляют способность к формированию нормальных микроколоний, тогда как без жгутиковые клетки P. aeruginosa вообще не способны к адгезии [32]. Это позволяет сделать вывод, что роль жгутиков и фимбрий в процессе формирования биоплёнки микроорганизмов различается от вида к виду.
Другим важным компонентом обеспечивающим адгезию бактериальных клеток к субстрату является липополисахарид (ЛПС). Так, у P. aeruginosa из двух основных типов ЛПС, нарушение биосинтеза Б-типа (но не А-типа) приводит к тому, что даже в случае нормального функционирования жгутиков и фимбрий, клетки P. aeruginosa теряют способность к взаимодействию с гидрофильными поверхностями [23]. У E.coli нарушение синтеза ЛПС так же приводит к нарушениям адгезии. Однако в данном случае сложно говорит о том, какую роль играет нарушение синтеза ЛПС в нарушении адгезии – прямую или опосредованную [5]. Это связанно с тем, что у E.coli нарушение синтеза ЛПС практически всегда сопровождается нарушениями в работе системы жгутиков и фимбрий I типа, тогда как у P. aeruginosa серьёзные нарушения в структуре ЛПС (вплоть до описанной выше потери одного из компонентов) редко сопровождаются ещё и дефектами синтеза или работы жгутиков и фимбрий [5].
На завершающих этапах адгезии важная роль отводится так называемым стабилизирующим факторам. Они имеют различную химическую структуру, чаще всего белковую или полисахаридную. Так, как указывалось выше, у P. aeruginosa одним из таких факторов является полисахарид Psl. Мутантные штаммы этого микроорганизма, дефектные по синтезу Psl не способны формировать биоплёнку, даже если система жгутиков и фимбрий IV типа функционирует нормально. Такие мутанты всё ещё способны взаимодействовать с субстратом, однако теряют способность прочно закрепляться на нём, что и лимитирует способность формировать биоплёнку.
У E.coli важнейшим стабилизирующим фактором является белок Ag 43 [4]. Этот белок-агглютинин располагается на внешней мембране клеток и обеспечивает стабилизацию адгезированных клеток на поверхности, а так же формирование интерклеточных связей на позднем этапе адгезии. Стабилизирующую функцию на поздних этапах адгезии так же играют амеллоиды и Bap-подобные белки бактерий.