1.4.2. Белки матрикса биоплёнки.

Вторым по содержанию компонентом матрикса биоплёнки являются экзобелки. В некоторых природных биоплёнках их количество может приблежаться к количеству экзополисахаридов, а иногда и превосходить их [17, 24]. Белки матрикса биоплёнки делятся по своему назначению на две большие группы:

1. Структурные белки

2. Экзоферменты

В биоплёнках обнаруживается значительное количество различных экзоферментов, многие из которых вовлекаются в деградацию биополимеров. Субстратом для этих ферментов являются водорасстворимые компоненты (такие как полисахариды, нуклеиновые кислоты и белки), а так же некоторые водонерасстворимые полимеры (целлюлоза, хитин, липиды) и различные органические частицы захваченные биоплёнками [69]. Основные ферменты матрикса биоплёнки приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Основные ферменты матрикса биоплёнки^*

Механизм действия ферментов	Наименование ферментов
Разрушение белков	Протеазы Пептидазы
Разрушение поли- или олигосахаридов	Эндоцеллюлазы Хитиназы α-глюкооксидазы β-глюкооксидазы β-ксилозидазы N-ацетил-β-глюкозаминидазы Хитобиозидазы β-глюкуронидазы
Фосфомоноэстеразная активность	Фосфотазы
Оксидоредуктазная активность	Фенолоксидазы Пероксидазы

*- по материалам [70].

Присутствие в матриксе биоплёнки ферментов обеспечивающих его деградацию, способствует распаду биполимеров на низкомолекулярные продукты, которые впоследствии могут быть использованы клетками в качестве источника углерода и энергии. Эти же ферменты участвуют и в завершении жизненного цикла биоплёнки, провоцируя открепление клеток. Некоторые другие ферменты, такие как эластаза и гиалуронидаза являются важнейшими факторами патогенности, обеспечивающие развитие инфекционного процесса.

Некоторые ферменты матрикса биоплёнки бактерий и грибов представляют значительный коммерческий интерес. Благодаря широкому спектру различных ферментов в составе матрикса, многие биоплёнки могут быть использованы для биоочистки, например сточных вод, от органических загрязнений.

Ферменты матрикса также используются микроорганизмами для деградации синтетических полимеров. Более того, ферменты матрикса биоплёнки, которые участвуют в поддержании окислительно-восстановительного потенциала, обуславливают биокоррозию.

Ферменты хорошо интегрируются в матрикс биоплёнки, в связи со своей способностью иммобилизироватся на экзополисахаридах [69, 70]. Например, у P. aeruginosa экзолипаза LipA иммобилизируется на альгинате за счёт слабого взаимодействия [34]. Иммобилизация ферментов на полисахаридных цепях способствует повышению их активности, а также, обеспечивает протекание реакций, катализируемых этими ферментами, на оптимальном расстоянии от клеток, что приводит к оптимизации процесса поглощения клетками конечных продуктов этих реакций. Более того, взаимодействие ферментов и ЭПС повышает их термостабильность и резистентность к протеолизу [58].

Многие экзоферменты микроорганизмов активно участвуют в деградации компонентов матрикса биоплёнки в результате недостатка питательных веществ [17, 73]. Примером компонентов матрикса, подвергаемым ферментативному разрушению в случае недостатка питательных веществ могут служить декстран, инулин и леван, синтезируемые бактериями рода Streptococcus в ротовой полости, а также леван который присутствует в так называемых „матричных пустотах”^* биоплёнки Pseudomonas syringae [30, 50]. Экзополисахариды обычно разрушаются путём гидролиза или лизиса, однако, скорость такой деградации является достаточно низкой [63]. В морских стоматолитах экзополисахариды и белки матрикса секретируются бактериями, и, затем быстро фрагментируются и перестраиваются, обычно сульфат-редуцирующими бактериями в более стойкие полимеры [13].

Второй группой белков матрикса биоплёнки являются структурные белки, такие как белки, ассоциированные с клеточной поверхностью и глико пептиды (лектины). Структурные белки играют важную роль в стабилизации и поддержании структуры биоплёнки, обеспечивая формирование полисахаридных сетей, а так же обеспечивая их связь с поверхностью клеток микроорганизмов [20]. Примерами таких белков могут служить глюкансодержащий белок S. mutans, лектины внешней мембраны Azospirillum braziliensis, а так же галактозо-специфичный LecA и фукозо-специфичный LecB P. aeruginosa вовлечённые в процесс формирования биоплёнки этим микроорганизмом [14, 21, 25, 31, 36, 62,]. Синтетические высоко-аффинные мультивалентные лиганды поражающие LecB, не только ингибируют процесс формирования биоплёнки P. aeruginosa, но и индуцируют распад уже сформированных биоплёнок этого микроорганизма вне зависимости от их возраста и стадии развития. Подобное происходит из-за того, что комплекс лиганд-LecB теряет способность осуществлять стабилизирующую функцию [25]. Было показано, что секретируемый белок CdrA способен напрямую присоединяться к Psl в биоплёнке P. aeruginosa [6]. Было выдвинуто предположение, что это белок может существовать в двух формах – экстраклеточной, и мембранносвязанной.

__________________________________________________________________

^*матричные пустоты – поры и каналы внутри матрикса биоплёнки, содержащие липиды и воду, но не содержащие гидратированные молекулы полисахаридов.

Экстраклеточная форма CdrA способствует связыванию цепей Psl между собой, тем самым, усиливая жёсткость структуры матрикса, а мембранносвязанная форма обеспечивает взаимодействие между матриксом и клетками.

Второй важнейшей группой структурных белков матрикса биоплёнки являются поверхностные белки, ассоциированные с биоплёнкой (Bap) S. aureus и Вар-подобные белки. Это высокомолекулярные белки, находящиеся на поверхности клеток и обуславливающие формирование биоплёнки некоторыми видами бактерий [29]. Они содержат коровый домен, состоящий из тандемных аминокислотных повторов, которые необходимы для формирования биоплёнки, а так же для проявления патогенных свойств. Другими важными белковыми компонентами матрикса биоплёнки являются амилоиды. Амилоиды представляют собой упорядоченные белковые повторы произвольной длинны, формирующие фибриллы содержащие боковые цепи с β-складчатой вторичной структурой. Эти цепи распологаются перпендикулярно к основной оси амилоидов [42]. Амилоиды вовлекаются в процесс адгезии к не живым поверхностям и клеткам живых организмов, в течении процесса инвазии, а так же выполняют функцию цитотоксинов [42].

Наконец, важную роль в процессе формирования биоплёнки выполняют сложные белковые структуры находящиеся на поверхности клеток микроорганизмов, такие как жгутики, фимбрии и пили. Не являясь формально компонентами матрикса, эти структуры обеспечивают взаимодействие клеток с компонентами последнего. Так, фимбрии IV типа P. aeruginosa способны связывать внеклеточную ДНК и, возможно, играют связующую роль между клетками и компонентами матрикса [53]. У Salmonella typhimurium и Escherichia coli биосинтез тонких аггрегативных фимбрий и целлюлозы, приводит к быстрому формированию ригидного гидрофобного матрикса. Нарушение же синтеза таких фимбрий приводит к образованию белее хрупкого матрикса, даже если синтез целлюлозы не нарушен [47].