1.4.1. Полисахариды матрикса биоплёнки.

Среди всех компонентов входящих состав матрикса биоплёнки основную роль в его построении играют экзополисахариды (ЭПС). В количественном соотношении это наиболее распространённые в матриксе биополимеры. В среднем, в зависимости от конкретной биоплёнки их количество варьирует от 50 до 90 % от общей сухой массы веществ матрикса. Большинство экзополисахаридов биоплёнки представляют собой достаточно длинные полимеры с молекулярной массой от 0,5 х 10⁶ до 2 х 10⁶ дальтон [20]. На сегоднешний день полисахариды найдены в матриксах биоплёнок практически всех микроорганизмов. Применение различных биохимических методов, а так же методов электронной и флуорисцентной микроскопии (с использованием меченных флуорисцентными красителями лектинов и моноклональных антител) позволило детально охарактеризовать многие из этих биополимеров [60]. Основная роль полисахаридов в составе матрикса биоплёнки – придание жесткости конструкции за счёт взаимодействия между отдельными полимерами. Это обусловлено тем, что между цепями ЭПС осуществляются слабые физико-химические взаимодействия, стабилизирующие структуру (рис. 4).

Рис. 4. Слабые физико-химические взаимодействия между цепями ЭПС матрикса биоплёнки [20].

Среди таких взаимодействий можно выделить следующие:

1. Формирование водородных связей – образуются между ОН – группами обращёнными во вне от основного полимерного скелета.

2. Электростатические взаимодействия – возникают между гидрофильными и гдрофобными группами полисахаридных цепей (например, между ОН – и СН₃ – группами)

3. Ионные взаимодействия – обусловлены связыванием отрицательно заряженных групп полисахаридных цепей посредством катионов двухвалентных металлов ( например, СОО^--Са²⁺-^-ООС)

4. Силы отталкивания – возникают между одинаково заряженными группами предотвращая коллапс структуры.

5. ван дер Ваальсовы взаимодействия – ориентированные взаимодействия в тех участках полисахаридных цепей где внешние группировки полисахаридов формируют диполи.

По своему составу полисахариды матрикса биоплёнки можно разделить на два основных типа – гомополисахариды и гетерополисахариды. Гомополисахариды в составе матрикса биоплёнки встречаются лишь у относительно небольшого числа микроорганизмов. Они обычно представляют собой производные сахарозы, например, глюканы и фруктаны синтезируемые бактериями рода Streptococcus в биплёнках на поверхности зубов, и целлюлоза, синтезируемая Gluconobacter xylinus, Agrobacterium tumifaciens, Rhizobium spp. а так же некоторыми представителями семейства Enterobacteriaceae [74].

Экзополисахариды матрикса биоплёнки большинства бактерий относятся к гетерополисахаридам, которые представляют собой смесь из нейтральных и заряженных остатков сахаров. Так же они содержат значительное количество различных органических и неорганических заместителей, которые в значительной степени влияют на их физические и биологические свойства. Так, в связи с наличием в составе уроновых кислот (а так же иногда пирувата и сульфатов) некоторые такие полисахариды, включая альгинат, ксантан и колановую кислоту являются полианионными. Так же существуют и поликатионные адгезины. Примером может служить интерклеточный адгезин бактерий Staphylococcus aureus и S. epidermidis состоящий из остатков β-1,6-N-ацетилглюкозамина. У S. epidermidis так же имеется экзополисахарид состоящий из 130 остатков 2-деокси-2-амино-D-глюкопиронозила [11, 48]. Характерной особенностью этого экзополисахарида является то, что он существует в двух формах – мажорной (около 80 %) и минорной. Минорная форма этого полисахарида отличается тем, что содержит меньшее количество не-N-ацетиллированных остатков, а так же содержит значительное количество фосфатных остатков [11, 48].

Состав экзополисахаридов матрикса биоплёнки может значительно различаться не только у разных видов микроорганизмов, но и в пределах штаммов одного вида. Например, разные штаммы S. termophillus синтезируют гетерополисахариды которые отличаются друг от друга составом мономеров и молекулярной массой [65]. У P. aeruginosa в составе матрикса биоплёнки обнаружено как минимум три экзополисахарида отличающиеся по химическому строению и физико-химическим свойствам – Pel, Psl и альгинат [51]. Альгинат является наиболее изученным экзополисахаридом матрикса биоплёнки P. aeruginosa. По своему химическому составу он относится к классу анионных гетерополисахаридов, который строится из уроновых кислот. Альгинат является неразветвлённым гетерополимером с высокой молекулярной массой состоящим из 1,4-связанных остатков β-D-маннуроната и α-L-гулуроната. Эти мономеры укладываются в гомополимерные блоки полиманнуроната и гетерополимерные последовательности со случайно расположенными остатками α-L-гулуроната и частично с O-ацетилированными остатками манноуроната [20]. Сверхпродукция этого экзополисахарида обуславливает принадлежность к мукоидным штаммам P. aeruginosa и вызвана мутацией в гене mucA который негативно регулируется σ-фактором AlgU. Альгинат вовлекается в процесс образования микроколоний на ранних этапах формирования биоплёнки P. aeruginosa, однако, он играет большую роль и в процессе стабилизации зрелой биоплёнки. У немукоидных штаммов P. aeruginosa эту роль выполняют Pel и Psl. Pel, это полисахарид с высоким содержанием глюкозы, тогда как Psl является структурой состоящей из повторяющихся пентасахаридных последовательностей содержащих D-маннозу, D-глюкозу и L-рамнозу [7]. Pel является необходимым для формирования так называемых пеликлов – биоплёнок образующихся на границе раздела фаз воздух-жидкость, тогда как Psl обеспечивает прекрипление к абиотическим и биотическим поверхностям, а так же формирование соответствующей архитектуры биоплёнки P. aeruginosa. Psl заякоривается на поверхности клеток в виде спиралей, и, возможно, обеспечивает аггригацию клеток между собой [32].

Для многих микроорганизмов экзополисахариды являются ключевыми для процесса формирования биоплёнки. Мутантные штаммы этих микроорганизмов, дефектные по синтезу экзополисахаридов, либо совсем не могут формировать зрелые биоплёнки, либо этот процесс у них значительно нарушается [10, 32, 67,]. Иногда такие мутанты, однако, сохраняют способность к адгезии, а так же ограниченную способность к формированию микроколоний. Однако, в поливидовых биоплёнках при наличии в их составе видов синтезирующих собственные экзополисахариды, такие мутанты получают возможность интегрироваться в состав сообщества [59]. Поэтому, пропорция разных экзополисахаридов в смешанных биоплёнках не всегда совпадает с биоразнообразием такого сообщества [56].