kinetics_problem

CH3COCH3 + I2 H+ CH3COCH2I + HI

При стехиометрических соотношениях реагентов скорость этой реакции не зависит от концентрации иода. Наблюдается функциональная зависимость между наблюдаемой (эффективной) константой скорости и

значением константы диссоциации кислоты вида: kэф Kan . Изучив экспериментальные данные, определите значения параметров n и .

212

ГЛАВА 10 . КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ

РЕАКЦИЙ

10.1. ОЦЕНКА КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Рассмотрим самую простую реакцию превращения субстрата (S) в продукт (Р) при участии фермента (Е).

Уже в ранних работах было обнаружено, что начальная скорость ферментативной реакции, при фиксированной концентрации фермента и малых концентрациях субстрата, изменяется линейно с концентрацией субстрата, но для высоких концентраций субстрата скорость реакции уже не зависит от его концентрации.

Л. Анри (1903 г.) первым предложил идею, что фермент образует с субстратом промежуточный комплекс. Развил эту идею Л. Михаэлис.

Согласно этой идее, механизм процесса можно представить состоящим из двух стадий. Первая — обратимая и быстрая, вторая — необратимая и медленная:

Для данного механизма скорость реакции определяется скоростью образования продукта реакции Р:

Скорость образования промежуточного продукта ES равна:

Уравнения материального баланса для фермента и субстрата имеют

вид:

где cE0 и cS0 — начальные концентрации фермента и субстрата; cE и cS — их текущие концентрации; cES — концентрации промежуточного соединения и продукта реакции.

213

Решение системы из трех уравнений (10.1)–(10.3) находим из следующих условий:

1)для t 0 , P 0 , следовательно cS0 cS cES ;

2)обычно cS0 >> cE0 , поэтому cS0 cS ;

3) считают, что концентрация промежуточного соединения cES стационарна (на основе принципа стационарности Боденштейна),

т. е. ddctES 0.

Подставляя значение cES из (10.3) в (10.2) и решая его относительно cES при условии ddctES 0, получим:

Поделим числитель и знаменатель этого уравнения на k1 , тогда имеем:

Величину KM k 1 k2 принято называть константой Михаэлиса. k1

Подставляя уравнение (10.5) в (10.1), получим уравнение для скорости образования продукта в начальный момент времени:

Анализ уравнения (10.6) позволяет объяснить наблюдаемые на опыте закономерности:

1) если cS0 KM , тогда

214

то есть начальная скорость линейно зависит от концентрации субстрата. Этот факт полностью подтверждается экспериментальными данными;

2) если cS0 KM , тогда из уравнения (10.7) получаем:

то есть начальная скорость не зависит от концентрации субстрата, что так же соответствует опытным данным. Следовательно, порядок реакции по субстрату в этом случае будет нулевой, а скорость процесса достигает максимального значения. Поэтому уравнение (10.6) можно записать в виде:

Уравнение (10.9) в литературе известно как уравнение Михаэлиса– Ментена. KМ называется константой Михаэлиса, физический смысл которой можно сформулировать, анализируя уравнение (10.9).

Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата ( KM cS0 ), при которой активность фермента составляет половину

максимальной, т. е. v0 vmax / 2, и имеет размерность концентрации,

моль/дм3. Численные значения KМ обычно лежат в пределах 10–2–10–8 М, легко воспроизводятся и не зависят от концентрации фермента. В то же время KМ является функцией температуры, рН среды, зависит от присутствия других веществ, играющих роль ингибитора или активатора.

Если для рассматриваемого механизма реакции выполняется усло-

вие k 1 >> k2 , тогда KM k 1 KS , где KS — субстратная константа, k1

т. е. константа диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и субстрат, характеризующая меру связывания фермента с субстратом. В общем случае KM KS , причем экспериментальное значение

KM представляет собой максимальное значение KS .

Только для ферментов разложения пероксида водорода, каталазы и пероксидазы, для которых k 1 << k2 , константа Михаэлиса KM k2 / k1

сильно отличается от субстратной константы KS .

Величину k2 (размерность [t–1]) называют также числом оборотов

фермента, так как она указывает на число моль субстрата, превращенных в продукт одним молем фермента в единицу времени. Для сложных

215

реакций константу k2 в уравнении Михаэлиса–Ментена обычно заменяют на kкат — каталитическую константу с той же размерностью.

Второй способ (вторая форма уравнения Лайнуивера–Берка)

216

отрезок, равный KM .

Третий способ (способ Эдди–Хофсти)

Если умножить обе части уравнения (10.10) на (vmaxv0 ), то оно приводится к виду:

График, построенный в координатах v0 v0 , дает прямую линию,

cS0

тангенс угла наклона, которой равен KM , а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен vmax . Кроме того, отрезок, отсекаемый на оси абсцисс,

Указанные способы лианиризации уравнения Михаэлиса–Ментена охватывают различные области концентрации субстрата, когда возможны отклонения от линейности. Поэтому полезно значения KM иvmax , оп-

ределенные различными способами, сравнивать между собой. Нетрудно показать, что аналогичная (10.9) форма уравнения может

быть получена и для более сложных механизмов реакции. Например, когда субстрат взаимодействует с ферментом по схеме:

Выражение для начальной скорости имеет вид:

элиса–Ментена и также легко линеаризуется.

217

Возможно протекание более сложных ферментативных реакций с участием двух субстратов.

10.2. ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ НА КИНЕТИКУ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Вещества, присутствие которых в системе понижает активность фермента, то есть уменьшает скорость реакции, называются ингибиторами.

Эффект ингибирования может происходить по разным причинам.

1. Ингибитор I конкурирует с субстратом за активный центр, так как по строению близок к нему и является псевдосупстратом, образуя с ферментом неактивный комплекс:

E + I k1 EI

k 1

Константа диссоциации комплекса ЕI называется константой ингибирования:

KI ccEcI .

EI

Начальная скорость реакции в присутствии ингибитора всегда меньше, чем при его отсутствии.

Если при увеличении концентрации субстрата в растворе активность фермента восстанавливается, такое ингибирование называется конкурентным.

Предельное значение скорости не зависит от присутствия ингибитора:

vmax k2cE0 .

Уравнение Михаэлиса–Ментена в присутствии ингибитора в этом случае имеет вид:

218

где

эффективная константа, зависящая от cI0 и KI .

Если cI0 KI и cS0 KM , то скорость реакции ингибирования будет

равна vmax /3 .

Выражение для константы ингибирования выразим из (10.15):

эффективную константу реакции в присутствии ингибитора и константу Михаэлиса — в его отсутствие. KM,эф и KM можно найти, решая задачу

графическим методом, например, в координатах Лайнуивера–Берга:

1 10 , для случая протекания процесса с ингибитором и без ингибито- v0 cS

ра. Константу ингибирования можно рассчитать по уравнению (10.16) или определить непосредственно из графика, так как отношение тангенсов угла наклона прямых в точке пересечения с осью ординат равно

2. Ингибитор не конкурирует с субстратом за активный центр, так как присоединяется к другой части молекулы белка с образованием неактивных комплексов (EI и ESI), имеющих константы равновесия:

Наличие ингибитора в этом случае приводит к снижению активности фермента, но не изменяет его сродство к субстрату.

Если достигается обратимость ингибирования, то есть восстановление активности фермента под действием отличных от субстрата веществ, такое ингибирование называется неконкурентным.

219

Если оба комплекса (EI и ESI) неактивны, то есть не дают продукта, а константы их диссоциации близки между собой ( KI K ), то это

равносильно дополнительному условию: ингибитор не мешает взаимодействию субстрата с ферментом, но уменьшает скорость реакции из-за неактивности образующихся комплексов на поверхности фермента.

В этом случае константа Михаэлиса остается постоянной величиной, а изменяется максимальная скорость процесса:

равна vmax / 4 .

Выражение для константы ингибирования получим из (10.18):

vmax / vmax,эф 1

Линеаризация уравнения (10.19) и обработка экспериментальных

данных для неконкурентного ингибирования в координатах 1 10 по- v0 cS

зволяет определить KM , vmax , vmax,эф и KI , зная cI0 .

3. При бесконкурентном ингибировании образуется один неактивированный комплекс (ESI) с константой равновесия

Уравнение Михаэлиса–Ментена в этом случае запишется как

220