Упражнение 1. Изучение гемолиза с помощью колориметра

Ход работы

Для работы приготавливают 1% суспензию отмытых эритроцитов крысы или человека в физиологическом растворе. Затем из нее готовят 2 разведения в 100 раз: одно – дистиллированной водой, другое – физиологическим раствором. Пропускание обоих растворов измеряют на ФЭК с красным светофильтром. Раствором для сравнения служит дистиллированная вода или физиологический раствор. Через 10, 30 и 60 мин после разведения растворов поводят повторные измерения. Следует убедиться в том, что пропускание суспензии, разведенной водой (гипотонический гемолиз), значительно превышает этот показатель в физиологическом растворе (контроль).

Упражнение 2. Измерение осмотической устойчивости эритроцитов

Ход работы

1. Налить в контрольную кювету колориметра раствор NаСl с концентрацией 0,9% и установить коэффициент пропускания 100%.

2. Налить во вторую кювету дистиллированную воду (С=0) и добавить в нее с помощью микропипетки исходную суспензию эритроцитов.

3. Поместить кювету с полученной суспензией в фотоэлектроколориметр и измерить ее коэффициент пропускания Т.

4. Произвести действия, аналогичные п. 2–3, с растворами NаСl различной концентрации С (от 0,1 до 0,9%). (В каждом опыте объемы растворов NаСl и исходной суспензии эритроцитов должны быть постоянными.)

5. Результаты измерений записать в таблицу.

С, %
Т, %

6. Построить график зависимости коэффициента пропускания суспензии от концентрации раствора NаСl и определить по нему осмотическую устойчивость эритроцитов (см. рис. 4).

Контрольные вопросы

1.В чем заключается явление осмотического гемолиза?

2. Что называется осмотической устойчивостью эритроцитов?

3. Охарактеризуйте турбидиметрический метод?

4. Каким образом можно определить осмотическую устойчивость эритроцитов?

5. Как изменяется коэффициент пропускания при возрастании числа лизированных клеток?

6. Почему для оценки степени протекания гемолиза измерение коэффициента пропускания следует проводить при 670 нм?

Лабораторная работа № 4 влияние уф-облучения на светопропускание раствора эритроцитов

Световое излучение, как известно, характеризуется длиной волны λ (в нанометрах, микрометрах) электромагнитных колебаний, частотой v (c^–1) и энергией квантов света (фотонов) Е (в джоулях):

Е = hv = hс / λ, (1.2)

где h – постоянная Планка (6,626 ·10^–34 Дж/c); с – скорость света. В работах по спектроскопии часто используют так называемое волновое число = 1/λ (см^–1), которое пропорционально частоте электромагнитных колебаний и, следовательно, энергии фотонов. В фотохимических экспериментах, когда количество вещества выражают в молях, а концентрацию – в молях на литр, удобнее использовать величину энергии, соответствующую не одному, а N_A фотонов, где N_A – постоянная Авогадро (6,023 ·10²³ моль^–1). Эта величина измеряется в джоулях на моль:

Е = Nhn = Nhc/λ. (1.3)

Из выражения (1.3) следует, что величина энергии зависит от длины волны света. Например, энергия излучения при λ=300 нм составляет 399 кДж/моль, а при 400 нм – 299 кДж/моль.

Поток излучения Ф (Вт/с) равен энергии, переносимой через некоторую поверхность S за единицу времени.

Интенсивность света выражают в виде плотности потока излучения, т.е. потока, падающего на единицу площади, перпендикулярной к направлению распространения света:

I = Ф / S. (1.4)

Доза излучения D (Дж/м²) (энергетическая экспозиция, количество облучения, экспозиционная доза) равна произведению интенсивности, умноженной на длительность облучения:

D = I t. (1.5)

При взаимодействии света с веществом могут происходить преломление световых лучей и их рассеяние, либо поглощение фотонов молекулами, или то и другое. Если произошло поглощение кванта света молекулой, то через 10 ^–9 – 10 с часть поглощенной энергии может иметь вид кванта света с большей длиной волны. Такое излучение называют люминесценцией. Существуют два вида люминесценции – флуоресценция и фосфоресценция, отличающиеся друг от друга временем жизни и энергией излучаемых фотонов. Изучение поглощения фотонов и люминесценции позволяет судить о строении молекулы или ее участков (хромофоров), поглощающих свет, а также осуществить их качественный и количественный анализ, выяснить физико-химические свойства среды, окружающей молекулы, или их хромофорные группы. На основании определении спектров поглощения и люминесценции можно построить схему энергетических уровней данной молекулы.

Каждая молекула имеет серию заполненных и свободных электронных орбиталей. Поглощение кванта света приводит к переходу электрона на орбиталь с большей энергией (молекула при этом переходит на более высокий энергетический уровень). Обратный переход может сопровождаться испусканием кванта люминесценции. Энергия поглощаемого или испускаемого кванта равна разности энергии между уровнями:

Е₂ – Е₁ = hv. (1.6)

Наряду с электронным переходом в молекуле, сопровождающимися испусканием фотона (флуоресценцией и фосфоресценцией), после поглощения кванта возможен ряд безызлучательных переходов с более высоких электронных уровней и колебательных подуровней на нижележащие уровни и подуровни. Если между молекулами в системе существует взаимодействие, то возможен безызлучательный перенос (миграция) энергии от одной молекулы к другой. Все эти процессы перераспределения энергии электронного возбуждения, начиная с поглощения кванта, называют фотофизическими.

Изучение биофизических аспектов фотобиологических процессов имеет большое значение в квантовой биофизике. К фотобиологическим относят процессы, начинающиеся с поглощения кванта света биологически важной молекулой и заканчивающиеся какой-либо (позитивной или негативной) физиологической реакцией на уровне организма. К ним относятся фотосинтез – синтез органических молекул за счет энергии солнечного света, фототаксис – движение организмов (например, бактерий) к свету или от него, фототропизм – поворот листьев или стеблей растений к свету или от света, фотопериодизм – регуляция суточных и годовых циклов жизни путем циклических воздействий свет — темнота, зрение – превращение световой энергии в энергию нервного импульса в сетчатке глаза или в аналогичных фоторецепторах, действие ультрафиолетовых лучей (бактерицидное или бактеристатическое) на микроорганизмы, мутагенное и канцерогенное влияние, образование витамина D из провитаминов, эритемное действие на кожу. К фотобиологическим процессам можно отнести биохемилюминесценцию (сверхслабые свечения, биолюминесценция). Фотобиологические процессы весьма разнообразны. Каждый из них состоит из многих стадий – начиная с акта поглощения кванта света и кончая физиологическими реакциями на уровне целого организма. Условно всякий фотобиологический процесс можно разделить на несколько стадий:

1) поглощение кванта света;

2) внутримолекулярные процессы обмена энергией (фотофизические процессы);

3) молекулярные процессы переноса энергии возбужденного состояния;

4) первичный фотохимический акт;

5) темновые реакции, заканчивающиеся образованием стабильных продуктов;

6) биохимические реакции с участием фотопродуктов;

7) общефизиологический ответ на действие света.

Первые три стадии фотохимического процесса одинаковы для процессов фотохимии и люминесценции, поэтому законы фотохимии схожи с законами люминесценции.

Квантовый выход Ф – это отношение числа прореагировавших молекул к количеству поглощенных фотонов. При первичных стадиях фотохимических реакций квантовый выход равен отношению числа возбужденных молекул вещества, вступающих в фотохимический процесс, к общему числу возбужденных молекул:

(продукты реакции),

Ф = dP / dA ^*= K₁ / (K₁ + K₂).

В реальных условиях опыта квантовый выход можно определить по убыванию исходного вещества ∆А или накоплению продукта реакции ∆Р за конечное время t под действием облучения объекта монохроматическим светом с интенсивностью 1 Вт/с:

Ф = – А [It (1–T)], (1.7)

где (1–T) – коэффициент поглощения; It – доза облучения.

Определяемый в опыте квантовый выход зависит от условий эксперимента. Так, поглощение действующего света продуктами реакции или посторонними веществами будет снижать Ф, а развитие цепных реакций, инициируемых первично образовавшимися радикалами, может привести к высоким квантовым выходам образования продуктов реакции (значительно больше единицы). Для понимания механизма фотохимического процесса особенно важен квантовый выход первичной реакции.

УФ-лучи представляют собой очень важный природный фактор, действие которого обусловливает в живых клетках фотохимические реакции. В широкой полосе УФ-лучей выделяют три области: УФ-А-излучение в области 400–325 нм, УФ-В-излучение в области 325–280 нм и УФ-С – в области 280–200 нм. Более коротковолновые лучи лежат в области глубокого вакуума (200–10 нм).

При анализе молекулярного механизма действия света на живые системы видно, что в первую очередь он влияет на биомембраны, выполняющие в клетке барьерную функцию, основанную на их низкой проницаемости для полярных молекул и ионов. Ультрафиолетовое облучение приводит к увеличению проницаемости мембран для различных веществ и, прежде всего, для ионов. Изменение ионной проницаемости клеточных мембран было обнаружено в дрожжах, яйцах морского ежа, водорослях, простейших и т.д. Эти эффекты не связаны с повреждением нуклеиновых кислот или ферментов, так как клетки в ряде случаев не теряют способности к размножению, а обмен веществ в них изменяется незначительно. Нарушение проницаемости мембран для ионов натрия и калия было выявлено при УФ-облучении безъядерных клеток, таких, как эритроциты человека. При этом наблюдались выходы калия из клетки, вход в нее натрия и, как следствие, нарушение осмотического баланса – набухание и лизис эритроцитов.

Повышение проницаемости отмечалось также и в мембранах субклеточных структур, например, в митохондриях и лизосомах. Из компонентов мембран наиболее выраженной чувствительностью к УФ-облучению обладают ненасыщенные жирные кислоты – олеиновая, линолевая, арахидоновая, а также соответствующие жирнокислотные остатки в фосфолипидах, из которых сформированы биологические мембраны. Молекулы этих ненасыщенных жирных кислот содержат одну, две, три и четыре двойные связи –СН=СН–, разделенные метиленовыми мостиками –СН₂–, т.е. двойные связи не сопряжены. Максимумы спектров поглощения ненасыщенных жирных кислот располагаются в области λ 220 нм. Так как в фотохимии обычно используют свет с длиной волн более 240 нм, прямые фотохимические превращения неокисленных жирных кислот происходить не могут. Фотопревращения липидов всегда сенсибилизированы. Одной из особенностей ненасыщенных жирных кислот является их легкая окисляемость кислородом воздуха по двойной связи. Этот процесс сопровождается образованием перекисных продуктов и является цепной реакцией, запуск (инициирование) которой происходит с появлением в системе свободных радикалов. В цепных реакциях свободные радикалы, реагируя с другими молекулами, не исчезают, а превращаются в новые, свободные.

Свободнорадикальное окисление липидов начинается с реакции инициирования. Инициаторами могут служить свободные радикалы аминокислот, радикалы воды, реакции продолжения цепи, реакции разветвления, когда гидропероксиды разлагаются, инициируя новые цепи. Разветвление происходит в присутствии ионов двухвалентного железа, под действием УФ-облучения или (значительно реже) спонтанно. Не все радикалы RO и R^• продолжают цепь. Некоторые рекомбинируются друг с другом, давая неактивные продукты. Кроме реакций спонтанного обрыва цепи могут прерываться антиоксидантами. Самым распространенным из них является витамин Е (токоферол), который при этом образует малоактивные радикалы. Наиболее активен витамин Е в относительно низких концентрациях ( in vitro 10^–6 моль), когда роль реакций невелика. Витамин Е имеет максимум поглощения 292 нм и при УФ-облучении легко фотолизируется.