Лабораторная работа № 8
Исследование влияния УФ-света на оптические свойства растворов оксигемоглобина
Цель работы: изучить оптические характеристики растворов оксигемоглобина, модифицированного воздействием различных доз УФ- света.
Ход работы
1 .Приготовить раствор оксигемоглобина в концентрации 1*10-5 моль/л.
В опытах используют водно-солевые растворы оксигемоглобина в концентрации 5*10-5 моль/л, который выделяют по методу Д. Л. Драбкина с модификацией Л. А. Блюменфельда из эритроцитов путем их осмотического гемолиза. Кровь, содержащую небольшое количество антикоагулянта (цитрат натрия или гепарин), смешивают с изотоническим (0,85 %) раствором хлорида натрия. Смесь центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин на центрифуге. Надосадочную жидкость, содержащую плазму и тонкий слой лейкоцитов, осторожно удаляют пипеткой Пастера. К осадку, содержащему эритроциты, добавляют 0,85 % раствор NaCl, осторожно перемешивают и снова центрифугируют при тех же условиях.
К полученной отмытой эритроцитарной массе в качестве гемолизирующего агента добавляют дистиллированную воду. Гемолиз проводят в течение 3 мин при периодическом перемешивании. Мембраны эритроцитов осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин. Надосадочная жидкость содержит преимущественно раствор оксигемоглобина. Полученный раствор гембелка разбавляют до необходимой концентрации, которая контролируется спектрофотометрически с использованием формулы:
где
[HbO2]
— концентрация оксигемоглобина; 
,
,
- значения оптической плотности
исследуемого раствора оксигемоглобина
при длинах волн 576, 560 и 540 нм соответственно.
2. Измерить оптическую плотность исследуемого образца при различных длинах волн. Данные занести в таблицу 1
3. Облучить раствор гембелка через светофильтр (240-390 нм) в течение 5 мин при следующих значениях энергии 120 000, 160 000, 200 000, 240 000, 280 000 мкДж/см2.
4. Измерить оптическую плотность фотомодифицированных растворов белка. Данные занести в таблицу 1.
Таблица 1 — Зависимость оптической плотности нативных и фотомодифицированных растворов оксигемоглобина человека от дозы УФ-света
|
Доза облучения мкДж/см2 |
0 |
120 000 |
160 000 |
200 000 |
240 000 |
280 000 |
|
Длина волны, нм |
Оптическая плотность
| |||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Построить спектры поглощения нативных и УФ-облученных растворов гемопротеида (по оси ординат отложить значения оптической плотности, по оси абсцисс - длины волн).
Построить график зависимости изменения оптической плотности от времени облучения в полулогарифмических координатах (по оси абсцисс - время облучения, мин; по оси ординат -lgD/D0, где D и D0 — оптическая плотность опытного и контрольного образца соответственно).
Рассчитать величину константы скорости фотопревращения гемоглобина (к, мин-1) по тангенсу угла наклона линейной зависимости логарифма изменения оптической плотности от времени фотомодификации.
Сделать выводы о влиянии УФ-света на оптические характеристики растворов гембелка