Лабораторная работа № 9 определение проницаемости кожи лягушки для ионов

Проницаемость связана с функционированием биологических мембран. Поскольку клетка – открытая термодинамическая система, она постоянно обменивается веществами с окружающей средой, благодаря способности клеток пропускать различные вещества через свою оболочку. Эта способность называется проницаемостью.

Проблема клеточной проницаемости включает исследование кинетики поступления (транспорта) веществ в клетку и из клетки и механизма распределения веществ между клеткой и средой в стационарных условиях. Изучение проницаемости клеток имеет огромное теоретическое и практическое значение. Все процессы жизнедеятельности клетки и организма (метаболизм, генерирование биопотенциалов, распределение веществ между клеткой и тканевой жидкостью) связаны с проницаемостью. Изучение процессов проницаемости имеет большое значение для биологии, сельского хозяйства, таких областей медицины, как терапия, фармакология и токсикология.

Перемещение веществ в клетку или из нее в окружающую среду может осуществляться многими способами. В зависимости от того, что является движущей силой перемещения, все виды переноса веществ можно разделить на пассивный и активный транспорт. В настоящее время различают первично- и вторично-активный транспорт.

В первично-активном транспорте одна из его стадий энергозависима. В кинетическом плане все они представляют собой единый механизм. Типичный пример первично-активного транспорта – активный транспорт ионов. Он осуществляется специальными ионными насосами, которые представляют собой интегральные белки клеточных мембран. Функция насосов заключается в переносе ионов через мембрану против электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ. В соответствии с этим ионные насосы обладают аденозинтрифосфатфосфогидролазной активностью. Общее свойство АТФ-аз первого типа – способность создавать ковалентный фосфолирированный интермедиат (Р), участвующий в реакционном цикле. К АТФ-азам этого типа относятся Na, K-АТФ-аза и Н-АТФ-аза плазматических мембран. Одна из наиболее важных и широко распространенных активных транспортных систем в клетках животных отвечает за перенос ионов Na⁺ и К⁺ через клеточные мембраны. Эта система известна как Na⁺- и К⁺-насосы и отвечает за стабилизацию высокой концентрации К⁺ и низкой концентрации Na⁺ внутри клетки. Активный транспорт Na⁺ и К⁺ имеет большое физиологическое значение. В состоянии покоя клетки на этот процесс затрачивается более 30 % АТФ, образующейся в ней. Активный транспорт Na⁺ и К⁺ необходим для активации электрической возбудимости нервных и мышечных клеток, а также ионов кальция в процессе Na- и Са-обмена.

Впервые фермент, расщепляющий АТФ, был обнаружен в 1957 г. Я. Скоу в нерве краба. Он проявлял свою активность при добавлении его в среду Na, K⁺ и Mg и был назван Na, К-АТФ-азой. По Скоу, фермент работает по такой схеме:

АТФ+Н₂ОАДФ+Ф_Н+Н⁺.

Скоу считает, что Na, K-АТФ-аза является интегральной частью Na- K-насоса, а расщепление АТФ обеспечивает энергией активный транспорт Na⁺ и К⁺_. Это предложение было подтверждено следующими экспериментальными данными.

1. Na, K-АТФ-аза обнаруживается во всех случаях, когда происходит активный транспорт Na⁺ и K⁺.

2. Уровень ферментативной активности коррелирует с количеством транспортируемых ионов.

3. Na, K-АТФ-аза и насос прочно связаны с плазматической мембраной.

4. Na, K-АТФ-аза и Na, K- насос одинаково ориентированы в мембране.

5. изменения концентрации Na⁺, K⁺ оказывают одинаковое действие на АТФ-азную активность и скорость транспорта этих ионов.

6. Сердечные гликозиды (дигитоксия и оуабаин) служат специфическими ингибиторами Na, K-АТФ-азы и Na, K-насосов.

Исследования процессов транспорта и ферментативной активности, проведенные на тенях эритроцитов, показали, что для активации АТФ-азы и переноса Na⁺ и K⁺ через мембрану ионы Na⁺ должны быть внутри, а ионы калия – снаружи. Только АТФ, находящаяся внутри клетки, способна служить эффективным субстратом Na, K-АТФ-азы; оуабаин и другие стероидные ингибиторы подавляют активность АТФ-азы при внешнем воздействии. Выяснить, как АТФ обеспечивает активный транспорт Na⁺ и K⁺, помог тот факт, что в присутствии Na⁺ и Mg²⁺ АТФ фосфорилирует Na, K-АТФ-азу. Участком фосфорилирования служит остаток аспартата. В присутствии К⁺ происходит гидролиз фосфорилированного промежуточного продукта [Е-Р]. Для реакции дефосфорилирования Na⁺ и Mg²⁺ не требуется:

Е+АТФЕ-Р+АТФ,

Е-Р+Н₂ОЕ+Ф.

Na⁺ – зависимое фосфорилирование и К⁺ – зависимое дефосфорилирование – не единственные реакции, имеющие определяющее значение. В процессе функционирования насос принимает по крайней мере две разные конформации, обозначаемые как Е₁ и Е₂. Всего же в транспорте Na⁺ и K⁺ и сопряженном с ним гидролизе АТФ участвуют не менее 4 конформационных форм фермента: Е₁, Е-Р, Е₂-Р_а, Е₂.

Несмотря на большое число данных о структуре Na, K-насоса, механизм его действия изучен недостаточно. Так, согласно модели, предложенной О. Ярдецким, структура белка должна удовлетворять трем условиям.

1. В белке должна быть полость такой величины, чтобы в ней помещались небольшие молекулы или ионы.

2. Белок должен существовать в двух конформациях, причем в одной из них полость должна быть открыта со стороны, обращенной внутрь клетки, а в другой – со стороны, обращенной кнаружи.

3.Указанные конформации должны иметь разное сродство к транспортируемым компонентам.

Рассмотрим эту модель применительно к транспорту Na и К. Две конформации белка – это формы Е₁ и Е₂. Известно, что полость на белке Е₁, связывающая ионы, обращена внутрь клетки, а на Е₂ – кнаружи.

Конформация Е₁ обладает высоким сродством к Na⁺, а Е₂ – к К⁺. Модель обусловлена двумя следующими факторами:

а) Na⁺ запускает фосфорилирование, а К⁺ - дефосфорилирование;

б) фосфорилирование стабилизирует конформацию Е₂, а дефосфорилирование – форму Е₁.

Следует отметить, что структурные различия между этими конформациями могут быть небольшими. Перемещение нескольких атомов на 0,2 нм может быть достаточным, чтобы изменить ориентацию полости и сродство к Na⁺ и К⁺. Существует множество случаев, позволяющих считать, что фосфорилирование способно вызвать изменения такого масштаба.

Установлено, что при гидролизе одной молекулы АТФ происходит перенос трех ионов Na⁺ и двух ионов К⁺. Следовательно, работа насоса вырабатывает (генерирует) электрический ток через мембрану. Максимальное число оборотов АТФ-азы – 100с^{– 1}.

Особо интересно то, что действие Na, К-насоса можно направить так, что он будет синтезировать АТФ из АДФ и Ф_Н. Этот синтез может происходить в условиях резко увеличенных ионных градиентов при инкубации эритроцитов в сердце с высокой концентрацией Na⁺ и низким содержанием К⁺.

По современным представлениям, Na, К-АТФ-аза представляет собой тетрамер, состоящий из 2α- и 2β-субъединиц. Общая молекулярная масса фермента равна 270 000.

Субъединицы α больше, чем β, и их молекулярная масса

соответствует 95 000–100 000. Они осуществляют гидролиз АТФ и

ответственны за связывание кардиотонических стероидных ингибиторов. Меньшая β-субъединица с молекулярной массой 40 000 содержит углеводные группы; α- и β-субъединицы связаны поперечными мостиками (связями). Исходя из этого можно считать, что α-субъединицы контактируют между собой, тогда как β-субъединицы пространственно разделены. Каждая α-субъединица пронизывает мембрану, а углеводные цепи β-субъединицы расположены на наружной стороне плазматической мембраны.

Принцип метода. Фотометрия в пламени – один из видов спектрального анализа, основанный на излучении (эмиссия) или поглощении (адсорбция) световой энергии атомами элементов в пламени. Излучение и поглощение света связано с процессами перехода атомов из одного энергетического состояния в другое. При излучении света эти переходы носят спонтанный либо вынужденный характер в результате воздействия внешнего излучения той же частоты, что и испускание. При низкой температуре пламени регистрируются легко диссоциирующиеся на атомы вещества. Фотометрия пламени не требует сложной аппаратуры, она проста в выполнении, отличается сравнительно высокой для физико-химических методов точностью. Особую ценность метод фотометрии пламени приобретает при анализе микроколичеств соединений щелочных и щелочноземельных металлов.

В настоящее время метод фотометрии пламени определяют около 50 элементов с ошибкой, не превышающей 2– 4 %.

Сущность метода определения концентраций ионов состоит в следующем: в пламя газовой горелки при помощи распыляющего устройства подается раствор анализируемого вещества в виде мельчайших капелек, где оно принимает парообразное состояние. Образовавшиеся при этом атомы элемента поглощают свет от стандартного источника или сами испускают излучение, которое фиксируется фотоэлементом. Возникающий в цепи фотоэлемента фототок измеряется чувствительным гальванометром. Величина его в определенных условиях изменяется пропорционально концентрации элемента в анализируемом растворе. Однако она зависит не только от концентрации свободных атомов в пламени, его температуры, концентрации распыляющего устройства и качества распыления, но и от степени диссоциации соединений на атомы и ионизации атомов в пламени.

При выполнении анализа необходимо прежде всего создать наиболее благоприятные условия для максимальной атомизации анализируемого вещества. В опыте используется пламя пропана, который предварительно смешивают с воздухом. Температура пламени равна 2 850 °С. Введение в пламя водного раствора какого-либо вещества и его диссоциация значительно снижают температуру. Анализируемый раствор распыляют при помощи струи сжатого воздуха, который, проходя через один из капилляров распылительной камеры, увлекает поверхностный слой жидкости из соприкасающегося с ним другого капилляра и разбрызгивает его в виде мелких капель. Качество работы распылителя характеризуется степенью дисперсности, массой образуемого аэрозоля, давлением подаваемого газа, физическими свойствами (вязкостью, плотностью, поверхностным натяжением) жидкости.

Диаметр капель аэрозоля уменьшается с падением вязкости и поверхностного натяжения распыляемого раствора, обусловленным температурой, поэтому опытные и стандартные растворы при фотометрировании должны иметь одинаковую температуру.

Препаровка кожи лягушки. Для получения препарата кожи лягушки необходимо взять ее в левую руку, прижать большим и указательным пальцами позвоночник в горизонтальной полости, другими – ноги лягушки к ладони. После этого ножницами перерезать позвоночный столб ниже головы и сразу умертвить лягушку, разрушив спинной и головной мозг специальной проволокой. Для опыта обычно берут участки кожи с боковой части тела округлой формы диаметром не менее 3 см. По окончании препаровки кожу помещают в чашку Петри с водопроводной водой. Исследования ионного транспорта проводят в специальной камере.